1. Ćwiczenie 8 1 Aminokwasy i białka 1 Aminokwasy



Pobieranie 308.99 Kb.
Strona2/4
Data07.05.2016
Rozmiar308.99 Kb.
1   2   3   4

1.4 Klasyfikacja protein

Przyjmuje się kilka różnych sposobów klasyfikacji związków poli(aminokwasowych). Do ważniejszych należą następujące sposoby podziału: na podstawie rozpuszczalności, ze względu na kształt cząsteczek, ze względu na budowę, na podstawie funkcji fizjologicznych.



Podział ze względu na rozpuszczalność należy do najstarszych prób klasyfikacji białek i jest nadal, choć w ograniczonym stopniu, stosowany w biochemii klinicznej, jednakże rozgraniczenia pomiędzy poszczególnymi klasami nie są ostre i przekonujące.

  • albuminy – białka o niewielkich masach cząsteczkowych, łatwo krystalizujące, rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli o pH mieszczącym się w przedziale 4-8,5. Nie zawierają żadnych szczególnych aminokwasów. Do grupy tej zaliczamy na przykład albuminy surowicy, laktoalbuminę, owoalbuminę i albuminy roślinne.

  • globuliny – są białkami słabo rozpuszczalnymi w wodzie ale dobrze rozpuszczalnymi w roztworach soli. W swojej strukturze nie zawierają żadnych szczególnych aminokwasów. Mają większe masy molowe niż albuminy. Do klasy tej zaliczyć można wiele białek plazmy, wiele enzymów, przeciwciał, białek mleka i roślinnych białek zapasowych (np.: edestyna z konopi, zeina z kukurydzy, arachidyna z orzechów ziemnych, glicynina z soi).

  • prolaminy – rozpuszczalne w 70-80% etanolu, nierozpuszczalne w wodzie i etanolu absolutnym. Są szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym. Zawierają duże ilości kwasu glutaminowego i proliny. Przykładami mogą być gliadyna (pszenica i żyto) oraz hordeina (jęczmień). Nie ulegają koagulacji podczas ogrzewania.

  • histony – rozpuszczalne w roztworach soli i kwasów organicznych zasadowe białka o małych masach molowych (100-250 reszt aminokwasowych). Spotyka się je we wszystkich tkankach organizmów eukariotycznych, gdzie stanowią istotny składnik chromatyny.

  • protaminy – rozpuszczalne w wodzie i kwasach białka o niewielkich cząsteczkach. Są bardzo silnie zasadowe, zawierają duże ilości aminokwasów zasadowych: argininy i lizyny. Występują w dużych ilościach w spermie, zarówno w płynie nasiennym jak i samych plemnikach, jądrach komórkowych, krwinkach. Punkt izoelektryczny przypada na 9,8-12.

  • gluteiny – nierozpuszczalne w wodzie, alkoholu i roztworach soli, rozpuszczalne w roztworach kwasów i zasad. Nie koagulują podczas ogrzewania. Występują w nasionach zbóż (aweniana w owsie, oryzeina w ryżu).

  • skleroproteiny – nierozpuszczalne w wodzie, roztworach soli, kwasów i zasad, Odporne na działanie enzymów białka występujące w organizmach zwierzęcych. Wzbogacone w glicynę, alaninę i prolinę. Należą do nich kolagen, elastyna, kreatyna, fibroina.

Na podstawie stosunku osiowego cząsteczki białka (stosunek długości do szerokości) możemy wyodrębnić dwie grupy. Białka globularne, dla których wartość tego stosunku jest mniejsza od 10, i na ogół nie przekracza 3-4, mają łańcuchy poliproteinowe silnie pofałdowane i zwinięte. Należą do nich albuminy, globuliny osocza, insulina, wiele enzymów. Białka włókienkowe (fibrylarne), dla których wartość stosunku osiowego jest większa niż 10, zawierają odcinki łańcuchów polipeptydowych zwiniętych śrubowo. Ich przedstawicielami są kolagen, kreatyna, mioglobina.

Ogólnie, substancje białkowe podzielić możemy na dwie grupy: białka proste i białka złożone. Do pierwszej, nazywanej proteinami, zaliczamy te z pośród białek, których cząsteczki są zbudowane wyłącznie z aminokwasów. Oczywiście, jest to grupa szalenie zróżnicowana, którą możemy dzielić dalej, na przykład ze względu na rozpuszczalność czy funkcje. Do drugiej zaliczamy związki zbudowane z łańcuchów polipeptydowych oraz zawierające dodatkowo wbudowane substancje lub grupy niebiałkowe. Klasę tą nazywamy proteidami. Grupę niebiałkową nazywamy często także grupą prostetyczną, albo, jeśli łatwo oddysocjowuje od części białkowej, koenzymem. Grupa prostetyczna może być związana z komponentem białkowym w różnym stopniu, silniej lub słabiej, dzięki występowaniu różnego typu oddziaływań. Ze względu na różnorodność grup nieaminokwasowych proteidy dzielimy na:



  • fosfoproteidy – są to białka zawierające resztę kwasu fosforowego, zwykle połączoną wiązaniem estrowym z grupą hydroksylową seryny lub, rzadziej, treoniny. Do grupy tej należy wiele ważnych fizjologicznie białek, na przykład kazeiny i witelliny. Stopień fosforylacji może być, w różnych białkach, różny.

  • chromoproteidy – białka te zawierają chromoforową (barwną) grupę prostetyczną. Część barwna może mieć różną strukturę: karotenoidową, flawonoidową, porfirynową i inne. Do ważnych chromoproteidów należą hemoproteidy, zawierające jako grupy prostetyczne porfirynowe kompleksy żelaza. Wiele białek z tej grupy pełni ważne funkcje w łańcuchu oddechowym.

  • lipoproteidy – są kompleksami białek z lipidami. Pełnią ważne funkcje fizjologiczne, związane z transportem lipidów, sterydów i witamin lipofilnych w ustroju. Wchodzą w skład błon cytoplazmatycznych. Dzieli się je, w zależności od wielkości cząsteczek oraz proporcji białko/lipid, na kilka podgrup.

  • glikoproteidy – są to pochodne białek, zawierające fragmenty oligosacharydowe przyłączone do łańcuchów bocznych niektórych aminokwasów wiązaniami glikozydowymi. Możliwe jest przyłączenie reszty cukrowej na kilka różnych sposobów:

  1. za pomocą wiązań O-glikozydowych do reszt hydroksylowych Thr, Ser lub Tyr

  2. poprzez wiązania N-glikozydowe do wolnych grup aminowych Lys lub reszt N-końcowych oraz azotu amidowego Asn i Gln

  3. poprzez wiązania estrowe z wolnymi resztami karboksylowymi aminokwasów kwaśnych oraz C-końcowych.

Fragmenty węglowodanowe zawierają głównie heksozy, heksozoaminy i kwas slajowy. Łańcuchy węglowodanowe są zwykle krótkie, zawierające 8-10 reszt sacharydowych. Glikoproteidy mogą zawierać jeden fragment węglowodanowy (np.: owoalbumina), znane są również takie, które zawierają znacznie większą ich ilość (np.: glikoproteid podszczękowy owcy zawiera 800 fragmentów oligosacharydowych). Łańcuchy cukrowe wprowadzane są do cząsteczek białka w fazie posttranslacyjnej przy udziale specyficznych glikozylotransferaz. Brak kontroli genetycznej na tym etapie prowadzi niekiedy do mikroheterogeniczności materiału. Glikoproteidy są szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym i zwierzęcym. Są składnikami błon, enzymami, przeciwciałami, czynnikami grupowymi krwi, hormonami, wchodzą w skład śluzów, białek plazmy. Są często odpowiedzialne za transport aktywny.

  • nukleoproteidy – są kompleksami kwasów nukleinowych i białek. Składnik białkowy ma na ogół charakter silnie zasadowy. Występują we wszystkich komórkach roślinnych jak i zwierzęcych, zarówno w jądrach komórkowych jak i w cytoplazmie. Odgrywają ważną rolę w replikacji DNA i kontroli genetycznej. Czystymi nukleoproteidami są fitofagi.

  • metaloproteidy ­– są kompleksami metali z białkami. Zdolność wiązania jonów niektórych metali z proteinami jest efektem oddziaływań z grupami aminowymi, karboksylanowymi, tiolowymi i imidazolowymi. Najczęściej wiązanymi metalami są żelazo, miedź, chrom, mangan, molibden, cynk i wapń. Nie należy mylić metaloproteidów z chromoproteidami zawierającymi jony metali. W metaloproteidach wiązanie metalu odbywa się bezpośrednio z cząsteczką białka, w chromoproteidach, jon związany jest z niebiałkowym ligandem, np.: porfiryną, a dopiero tak uzyskany kompleks wiąże się z łańcuchem polipeptydowym.



1.5 Reakcje aminokwasów i białek

1.5.1 Reakcja z ninhydryną

Wolne grupy aminowe aminokwasów reagują z ninhydryną z uwolnieniem amoniaku i dwutlenku węgla. Aminokwas w tych warunkach utlenia się do odpowiedniego aldehydu, natomiast ninhydryna, w obecności powstającego amoniaku, ulega redukcji do niebieskofioletowego barwnika.


Metoda ta, ze względu na dużą czułość, stosowana jest do spektrofotometrycznego oznaczania aminokwasów oraz do ich szybkiego wykrywania. Oczywiście podobną reakcję wykazują peptydy co wiąże się z obecności wolnych grup aminowych (podczas reakcji z peptydami nie wydziela się CO2). Reakcja ta nie jest specyficzna, ulegają jej również aminocukry i niektóre inne związki aminowe.


1.5.2 Odczyn ksantoproteinowy

Efektem działania na peptydy, zawierające aminokwasy aromatyczne, kwasem azotowym jest proces nitrowania reszt arylowych tyrozyny. Powstała pochodna nitrofenolu, jak wiele związków nitrowych, wykazuje żółte zabarwienie. Dodanie do próbki roztworu zasady, prowadzące do zalkalizowania środowiska, wywołuje zmianę barwy na pomarańczową, będącą efektem deprotonowania fenolu, z wytworzeniem intensywnie barwnego jonu fenolanowego (zjawisko podobne do mechanizmu działania niektórych wskaźników pH)





1.5.3 Odczyn Millona

W wyniku reakcji tyrozyny z kwaśnym roztworem azotanu(V) rtęci(II) tworzą się pochodne nitriofenoli, które w połączeniu z jonami Hg2+ wywołują ciemnoczerwone zabarwienie roztworu.


1.5.4 Odczyn biuretowy

W wyniku reakcji związków zawierających wiązanie peptydowe z jonami miedzi(II) w środowisku zasadowym powstają barwne, niebieskofioletowe kompleksy. Podobną reakcję wykazuje mocznik, który, w obecności zasady, tworzy dimer, zdolny do kompleksowania jonów miedzi w sposób podobny do peptydów.



Barwa jest tym intensywniejsza, im dłuższy jest peptyd (im więcej wiązań peptydowych wchodzi w skład cząsteczki)


1.5.9 Reakcje aminokwasów siarkowych

W reakcji cysteiny lub cystyny z gorącym roztworem NaOH powstaje siarczek sodu, który, w obecności rozpuszczalnych soli ołowiu(II) tworzy czarny osad PbS.



1.6 Strącanie, denaturacja i wysalanie białek
Białka wykazują dużą zmienność rozpuszczalności w zależności od pH roztworu, jego siły jonowej, stałej dielektrycznej rozpuszczalnika oraz temperatury.

Dodanie do wodnego roztworu białka mniej polarnego rozpuszczalnika, np.: etanolu czy acetonu, powoduje obniżenie względnej przenikalności elektrycznej układu. W efekcie obniża się stopień hydratacji i rozpuszczalność białek i peptydów. Wprowadzenie odpowiednio dużej ilości takiego rozpuszczalnika powoduje wytrącenie się białka.

Większość białek wykazuje najmniejszą rozpuszczalność w roztworze o pH bliskim ich punktowi izoelektrycznemu. W punkcie tym ładunek cząsteczki białka wynosi zero, zatem na cząsteczki nie działają odpychające siły elektrostatyczne (w pH różnym od punktu izoelektrycznego molekuły białka są obdarzone ładunkiem, zatem, na skutek oddziaływań coulombowskich odpychają się), co sprzyja agregacji cząsteczek białka. Ze względu na występowanie, w cząsteczkach białek, aminokwasów zasadowych lub kwasowych, na powierzchni molekuły tworzą się często centra (rejony), obdarzone lokalnym ładunkiem. By zapobiec oddziaływaniom przyciągającym miejscowych różnoimiennych ładunków pomiędzy molekułami protein, konieczna jest obecność w roztworze pewnej ilości jonów, które poprzez oddziaływania elektrostatyczna wiążą się z cząsteczkami białka, równoważąc w ten sposób ładunki lokalne, a co za tym idzie, zapewniając symetrię rozkładu potencjału elektrycznego i, gromadząc się na powierzchni cząsteczki, znoszą międzymolekularne oddziaływania elektrostatyczne, dodatkowo podwyższając stopień hydratacji, uniemożliwiając tym samym agregację i wytrącanie peptydu. Efekt ten, polegający na zwiększeniu rozpuszczalności białek w wyniku dodania pewnej ilości związków jonowych do roztworu obserwuje się szczególnie wyraźnie dla białek o dużej asymetrii rozkładu ładunków (np.: albuminy). Z drugiej strony, dodatek dużej ilości związków jonowych, powoduje wytrącanie białek (tzw. wysalanie). Jest to spowodowane odciąganiem cząsteczek wody, solwatującej molekuły białka, przez wprowadzone do roztworu jony soli, których hydratacja jest bardziej uprzywilejowana. Zniszczenie otoczki solwatacyjnej powoduje pojawienie się oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy cząsteczkami białka i ich aglomerację a w następstwie wypadanie z roztworu. Fakt, iż różne białka wytrącają się z roztworu przy różnym stężeniu czynnika wysalającego, stosowany jest do frakcjonowania mieszanin białek. Procesy wysalanie i wytrącania rozpuszczalnikami organicznymi nie mają większego wpływu na przestrzenną strukturę białka.

Denaturacją nazywamy takie procesy, przeprowadzone drogami fizycznymi lub chemicznymi, które prowadzą do zmiany w strukturze białka, co prowadzi do utraty bądź zmniejszenia aktywności lub innej cechy charakterystycznej tego białka, przy czym struktura pierwszorzędowa pozostaje niezmieniona. Procesy denaturacji wiążą się ze zniszczeniem wiązań wodorowych, stabilizujących drugo- trzecio- i czwartorzędową strukturę proteiny, oraz, w warunkach redukujących, rozerwaniem mostków (wiązań) disiarczkowych. W przypadku denaturacji łańcuch białkowy traci swoją, stabilizowaną niekowalencyjnymi oddziaływaniami oraz wiązaniami disulfidowymi, konformację i przechodzi, na skutek drgań termicznych, w strukturę nieuporządkowaną, o charakterze statystycznym (tzw. kłębek statystyczny). Forma taka nie wykazuje aktywności biologicznej. Usunięcie czynnika denaturującego powoduje wytworzenie wiązań wodorowych oraz disiarczkowych między różnymi miejscami łańcucha w sposób przypadkowy, a co za tym idzie ustabilizowanie nieaktywnej struktury. Umieszczenie białka w formie kłębka statystycznego w buforze o pH fizjologicznym, odpowiedniej sile jonowej i w warunkach pozwalających na zerwanie nieprawidłowych mostków S-S, prowadzi zazwyczaj do powolnej odbudowy aktywnej formy proteiny. Czynnikiem stosowanym do zrywania wiązań wodorowych jest za zwyczaj stężony roztwór mocznika lub guanidyny (oba związki charakteryzują się wieloma centrami protonodonorowymi i protonoakceptorowymi, co w połączeniu z ich małymi rozmiarami umożliwia im konkurowanie z wewnątrzcząsteczkowymi wiązaniami wodorowymi molekuły białka). Niszczeniu struktury drugorzędowej wielu protein sprzyja także pH mocno kwaśne bądź mocno zasadowe. Do zrywania mostków disiarczkowych używa się merkaptoetanolu, który, sam tworząc dimer, oddaje protony cząsteczce białka. Denaturacja pociąga za sobą również zmiany rozpuszczalności, położenia punktu izoelektrycznego (wyeksponowanie nowych grup zjonizowanych). Do fizycznych metod denaturacji należą: ogrzewanie, naświetlanie promieniowaniem ultrafioletowym, rentgenowskim lub jonizującym, działanie ultradźwiękami oraz, w niektórych przypadkach, silne mieszanie.

Jony metali ciężkich również wytrącają białka z roztworu. Mechanizm tego procesu polega na tworzeniu soli oraz kompleksów metali ciężkich (np.: ołowiu, rtęci, srebra, miedzi, kadmu itd.) z białkami -białczanów. W tworzeniu tego typu wiązań uczestniczą wolne reszty karboksylanowe (aminokwasów kwaśnych lub C-terminalnych), aminowe (aminokwasów zasadowych lub N-terminalnych), guanidynowe, imidazolowe i indolowe (Arg, His i Trp) oraz, w wiązaniu rtęci, ołowiu, złota, srebra i kadmu, reszty SH. Połączenia te charakteryzują się małymi wartościami stałych dysocjacji oraz niewielkimi iloczynami rozpuszczalności. W białczanach białko jest zatem anionem lub ligandem.

Właściwości kationowe cząsteczek białek wykorzystuje się podczas ich wytrącania za pomocą anionów. Tworzenie soli białek z jonami kwasów takich jak trichlorooctowy, sulfosalicylowy czy fosforowolframowy możliwe jest dzięki obecności w molekule proteiny reszt aminowych, argininowych, imidazolowych i indolowych.


1.7. Sacharydy
Sacharydy (węglowodany) to grupa związków organicznych, będących integralnymi składnikami komórek roślinnych i zwierzęcych, o charakterze alkoholi wielowodorotlenowych, zawierających grupy aldehydowe bądź ketonowe. Sacharydy dzielimy na cukry proste (monosacharydy) i złożone (polisacharydy i oligosacharydy).

1.7.1 Monosacharydy

Monocukry, będące pod względem chemicznym wieloalkoholoaldehydami (aldozy) lub wieloalkoholoketonami (ketozy), dzielą się w zależności od liczby węgli w cząsteczce na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy, heptozy itd. Mówimy zatem np. o aldotriozach, ketoheksozach itp. Numerację łańcucha węglowego węglowodanu rozpoczyna się od grupy aldehydowej (w przypadku aldoz) lub grupy hydroksymetylenowej połączonej z grupą ketonową (w przypadku ketoz).



Grupa karbonylowa w naturalnych ketozach występuje na atomie węgla C-2. Wszystkie cukry posiadają w cząsteczkach centra chiralności zatem wraz ze wzrostem długości łańcucha węglowego wzrasta liczba możliwych izomerów. W zależności od konfiguracji przy przedostatnim (licząc od grupy karbonylowej) atomie węgla dzielimy je na D oraz L. Cukry proste możemy ułożyć w szereg, w zależności od liczby atomów węgla. Na poniższym rysunku przedstawiono szereg D aldoz.



aldehyd D-glicerynowy



D-erytroza



D-treoza


D-ryboza


D-arabinoza



D-ksyloza



D-liksoza



D-alloza


D-altroza



D-glukoza



D-mannoza



D-guloza


D-idoza


D-galaktoza



D-taloza


Podobny szereg utworzyć można dla ketoz

D-erytruloza



D-rybuloza



D-ksyluloza



D-aluloza



D-fruktoza



D-sorboza



D-tagatoza


1   2   3   4


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna