34, 155 –157 Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes Europejska I śródziemnomorska Organizacja Ochrony Roślin Normes oepp eppo standardy



Pobieranie 286.24 Kb.
Strona2/4
Data28.04.2016
Rozmiar286.24 Kb.
1   2   3   4

Tabela 3 Typowe odczyty dla Erwinia amylovora w teście API 20E po 48 h

Test Odczyt (48 h)

ONPG Zmienna

ADH – (lub słaba+)

LDC –

ODC – CIT – SH2



URE –

TDA – IND –

VP + (lub zmienna)

GEL Zmienna

GLU +

MAN Zmienna



INO Zmienna

SOR Zmienna

RHA –

SAC +


MEL – (lub słaba +)

AMY –


ARA + (niektóre )
Profil kwasów tłuszczowych (FAP)
Lewan dodatnie, nie fluoryzujące kolonie powinny być hodowane na agarze sojowo-tryptonowym przez 48 godzin w 28C, a następnie poddawane stosownej procedurze analizy kwasów tłuszczowych. Wynik testu FAP podejrzanej kultury jest dodatni, gdy zostanie porównywany i uznany za identyczny z kontrolą pozytywną (Sasser, 1990).

Identyfikacja serologiczna
Test aglutynacji

Podejrzane, lewan-dodatnie, nie fluoryzujące na podłożu King B kolonie E. amylovora mogą być badane w teście aglutynacji na szkiełku podstawowym przez zmieszanie ich z kroplą buforu PBS (Załącznik I) i kroplą specyficznych na E.



163




Tabela 2 Różnice pomiędzy Erwinia amylovora, Erwinia pyrifoliae i Erwinia sp. izolowanych ze znekrotyzowanych kwiatów gruszy

Testy mikrobiologiczne

Erwinia amylovora

Erwinia pyrifoliae

Erwinia sp.

Upłynnianie żelatyny

+





Inozytol1



ND3

+

Sorbitol1

+

+



Eskulina1

V4



+

Melibioza1





+

D-Rafinoza1





+

-Gentobioza1

+



+

Amplifikacja2 z EP16A/EPI62CCPS1/CPS2C



+

ND3

1 = Roselló et al. (2003). Oksydacja substratów w API 50 CH (BioMérieux) wg zmodyfikowanego protokołu.

2 = wg Kim et al. (2001).

3 = ND: nie badano.

4 = V: Zmienne.




amylovora przeciwciał (nie rozcieńczone lub tylko w 5 lub 10 krotnym rozcieńczeniu). Przeciwciała monoklonalne mogą być używane tylko w przypadku, gdy wykazują aglutynację z referencyjnymi szczepami.
Test IF

Z lewan dodatnich, nie fluoryzujących kolonii przygotowywana jest w buforze PBS (Załącznik I) zawiesina o gęstości około 106 komórek w mililitrze, i stosowana jest procedura opisana w Załączniku III.



Testy ELISA

Test DASI-ELISA i bezpośredni test ELISA z wykorzystaniem specyficznych monoklonalnych przeciwciał mogą być stosowane do identyfikacji izolatu. Mieszanka przeciwciał monoklonalnych zastała poddana walidacji w ring teście. W przypadku DASI-ELISA, z podejrzanych kolonii przygotowywana jest zawiesina o gęstości około 108 komórek w mililitrze PBS (Załącznik I ). Procedura testu DASI-ELISA (Załącznik III) może być prowadzona bez etapu wstępnego wzbogacania. Gdy przeprowadzone będą tylko dwa testy identyfikacyjne i inokulacja, inne testy serologiczne nie muszą być zastosowane jako dodatkowe do tej metody. W przypadku testu bezpośredniego ELISA, powinna być przeprowadzona odrębna procedura zawarta w Załączniku III.



Identyfikacja molekularna
PCR

Z lewan dodatnich, nie fluoryzujących kolonii powinna być przygotowana zawiesina o gęstości około 106 komórek w mililitrze sterylnej wody do biologii molekularnej. Zastosowana powinna być właściwa procedura PCR, zgodnie z Załącznikiem III, bez ekstrakcji DNA.



Analiza makrorestrykcyjna z Xba i elektroforeza w polu pulsacyjnym (PFGE)

Analiza PFGE genomowego DNA po trawieniu enzymem Xba i zgodnie z Jock et al. (2002) daje 6 wzorców dla szczepów europejskich E. amylovora.

Pozwala ona na uzyskanie informacji użytecznych do różnicowania szczepów i może być wykorzystana do analizy rozprzestrzeniana sięzarazy ogniowej w Europie.

Test biologiczny
W celu potwierdzenia patogeniczności podejrzanymi po izolacji i wzbogacaniu koloniami E. amylovora powinny być zainokulowane rośliny testowe. Reakcja nadwrażliwości liści tytoniu może być wskaźnikiem obecności genu hrp, ale daje też wynik pozytywny dla wielu bakterii patogenicznych dla roślin. Używa się roślin tytoniu odmiany Xanthi lub Samsun z więcej niż 5-6 liśćmi. Zawiesina bakteryjna o gęstości 109 cfu ml1 (OD przy 620 nm=1.0) jest wstrzykiwana do przestrzeni międzykomórkowej w pełni rozwiniętych przy użyciu igły 25 GA 5/8 0.5  16 i strzykawki. Zupełny rozpad infiltrowanej tkanki po 24 godzinach w temperaturze pokojowej świadczy o pozytywnym wyniku reakcji.

Aby potwierdzić patogeniczność podejrzanych kolonii E. amylovora, konieczna jest inokulacja żywiciela zarazy ogniowej. Zawsze powinna być włączona pozytywna kontrola (czysta kultura znanego szczepu E. amylovora) i kontrola negatywna ze sterylnym buforem (Załącznik I). Oprócz tego rośliny zainokulowane kontrolą pozytywną i kontrolą negatywną powinny być trzymane z dala od innych roślin, ale w tych samych warunkach. Metody inokulacji zostały zawarte w Załączniku VI. Kolonie przypominające kolonie E. amylovora powinny być reizolowane z ogonków liściowych, roślin lub gałązek wykazujących typowe objawy choroby powodowanej przez E. amylovora.



Pomyłki możliwe z podobnymi gatunkami
Objawy chorobowe powodowane przez E. amylovora mogą być mylone z tymi, które powoduje Erwinia pyrifoliae, czynnik sprawczy bakteryjnego więdnięcia gałązek gruszy azjatyckiej (Pyrus pyrifolia) (Kim et al., 1999) i z tymi, które powodują nowe gatunki Erwinia izolowane z znekrotyzowanych kwiatów gruszy w Hiszpanii (Roselló et al.,2002). Ostateczna diagnoza powinna zawsze być uzyskana w drodze analiz laboratoryjnych.

Materiał referencyjny
Następujące izolaty E. amylovora są rekomendowane do wykorzystania jako kontrole pozytywne: NCPPB683 i CFBP 1430. Następujące kolekcje mogą dostarczyć odmienne szczepy referencyjne E. amylovora: (1) National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York (GB); (2) Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen ( NL); (3) Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francja. Autentyczność szczepów może być zagwarantowana tylko w przypadku bezpośredniego uzyskania z kolekcji kultur.

Wymagania dla pozytywnej diagnozy
Schematy 3 i 4 przedstawiają odpowiednio schemat testowania pod kątem obecności E. amylovora materiału z objawami choroby i bezobjawowego.

Kiedy E. amylovora diagnozowana jest po raz pierwszy, lub w krytycznych przypadkach (import /eksport) wymagane jest stosowanie się do następujących zasad:



  • objawy choroby, morfologiczna, biochemiczna, i molekularna charakterystyka patogenu i właściwości patogeniczne powinny być w zgodzie z opisem zawartym w protokole

  • podczas izolacji bakterii opisane charakterystyki morfologiczna, biochemiczna, molekularna i patogeniczna, i wymagania protokołu powinny być następujące

  • w przypadku infekcji latentnej, po wstępnych testach przesiewowych, patogen powinien zostać wyizolowany i właściwie zidentyfikowany w czystej kulturze, włącznie z testem patogeniczności

  • oryginalna próba (z etykietami, o ile ma to zastosowanie), ekstrakt próby i czysta kultura powinny być przechowywane w odpowiednich warunkach z właściwym zarejestrowaniem i powinny być dostępne w razie wątpliwości.



Sprawozdanie z diagnozy
Sprawozdanie z wykonania protokołu powinno zwierać:

  • informacje i dokumentację pochodzenia zainfekowanego materiału;

  • opis objawów (o ile to możliwe raczej ze zdjęciami);

  • opis morfologicznej, biochemicznej i patogenicznej charakterystyki bakterii;

  • informacje o rozmiarze infekcji;

  • właściwe komentarze co do pewności lub niepewności identyfikacji.



Informacje dodatkowe
Dodatkowe informacje na temat tego organizmu można uzyskać od: M. M. López (mlopez@ivia.es), Bacteriología, Department Protección Vegetal y Biotecnología, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA), Carretera Moncada-Náquera km 5, 46113 Moncada (Valencia), Spain; M. Keck, Bundesamt und Forschungszentrum für Landwirtschaft, Spargelfeldstrasse191, A-1226 Vienna PO Box 400, Austria.

Podziękowania
W oryginale protokół ten został napisany przez: M. M. López, M. Keck, P. Llop, M. T. Gorris, J. Peñalver, V. Donat i M. Cambra., IVIA, Moncada (Valencia) (ES).

Protokół ten poddawany był ringtestowi w różnych europejskich laboratoriach2.


Referencje

Ayers SH, Rupp P & Johnson WT (1919) A Study of Alkali Forming in Milk. USDA Biuletyn no. 782. Washington (US).

Bereswill S, Bugert P, Bruchmuller I & Geider K (1995) Identification of the fireblight pathogen, Erwinia amylovora by PCR assays with chromosomal DNA. Applied and Environmental Microbiology 61, 2636 –2642

Bereswill S, Jock S, Aldridge P, Janse JD & Geider K (1997) Molecular characterization of natural Erwinia amylovora strains deficient in levan synthesis. Physiological and Molecular Plant Pathology 51, 215 –225

Bereswill S, Pahl A, Bellemann P, Zeller W & Geider K (1992) Sensitive and species-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction analysis. Applied and Environmental Microbiology 58, 3522–3526.

Bonn WG & van der Zwet T (2000) Distribution and economic importance of fireblight. In: Fireblight, the Disease and its Causative Agent Erwinia amylovora (Ed. Vanneste, J). CAB International, Wallingford (GB).

Bradbury JF (1986) Guide to Plant Pathogenic Bacteria. CAB International, Wallingford (GB).

Burrill TJ (1883) New species of Micrococcus. American Naturalist 17, 319.

Dye DW (1983) Erwinia: the ‘amylovora’ and ‘herbicola’ groups. In: Plant Bacterial Diseases, a Diagnosis Guide (Ed. Fahy PC & Persley GJ). Aca- demic Press, Sydney (AU).

EPPO/CABI (1997) Erwinia amylovora. Quarantine Pests for Europe, 2nd edn, pp. 1001–1007. CAB International, Wallingford (GB).

EPPO/CABI (1998) Map 257. In: Distribution Maps of Quarantine Pests for Europe. CAB International, Wallingford (GB).

EU (1998) Council Directive 98/57 EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum. Official Journal of the European Communities L235, 1–39. Gorris MT, Cambra M, Llop P, López MM, Lecomte P, Chartier R & Paulin JP (1996b) A sensitive and specific detection of Erwinia amylovora based on the ELISA-DASI enrichment method with monoclonal anti- bodies. Acta Horticulturae no. 411, 41– 45.

Gorris MT, Cambra E, López MM, Paulin JP, Chartier R & Cambra M (1996a) Production and characterization of monoclonal antibodies spe- cific for Erwinia amylovora and their use in different serological tech- niques. Acta Horticulturae no. 411, 47–51.

Guilford PJ, Taylor RK, Clark RG, Hale CN, Forster RLS & Bonn WG (1996) PCR-based techniques for the detection of Erwinia amylovora. Acta Horticulturae no. 411, 53 –56.

Ishimaru ES & Klos EJ (1984) New medium for detection of Erwinia amy- lovora and its use in epidemiological studies. Phytopathology 74, 1342–1345.

Jock S, Donat V, López MM, Bazzi C & Geider K (2002) Following spread of fireblight in Western, Central and Southern Europe by molecular dif- ferentiation of Erwinia amylovora strains with PFGE analysis. Environ- mental Microbiology 4, 106 –114.

Jones A & Geider K (2001) II Gram negative bacteria. B. Erwinia and Pantoea. In: Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria (Ed. Schaad NW, Jones JB & Chum W), 2nd edn. APS Press, St Paul (US).

Kim WS, Gardan L, Rhim SL & Geider K (1999) Erwinia pyrifoliae sp., a novel pathogen that affects Asian pear trees (Pyrus pyrifolia). Interna- tional Journal of Systematic Bacteriology 49, 899 –906.



Kim WS, Jock S, Rhim SL & Geider K (2001) Molecular detection and dif- ferentiation of Erwinia pyrifoliae and host range analysis of the Asian pear pathogen. Plant Disease 85, 1183 –1188.

King EO, Ward M & Raney DE (1954) Two simple media for the demon- stration of pyocyanin and fluorescein. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 44, 301–307.

Lecomte P, Manceau C, Paulin JP & Keck M (1997) Identification by PCR analysis on plasmid pE29 of isolates of Erwinia amylovora responsible of an outbreak in Central Europe. European Journal of Plant Pathology 103,

91– 98. Llop P, Bonaterra A, Peñalver J & López MM (2000) Development of a

highly sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of Erwinia amylovora in asymptomatic plant material. Applied and Environmental Microbiology 66, 2071–2078.

Llop P, Caruso P, Cubero J, Morente C & López MM (1999) A simple extraction procedure for efficient routine detection of pathogenic bacteria in plant material by polymerase chain reaction. Journal of Microbiologi- cal Methods 37, 23–31.

Maes M, Garbeva P & Crepel C (1996) Identification and sensitive endo- phytic detection of the fireblight pathogen Erwinia amylovora with 235 ribosomal DNA sequences and the polymerase chain reaction. Plant Pathology 45, 1139 –1149.

McManus PS & Jones AL (1995) Detection of Erwinia amylovora by nested

PCR and PCR-dot-blot and reverse blot hybridisations. Phytopathology 85, 618–623.

OEPP/EPPO (1992) EPPO Standards PM 3/40 Erwinia amylovora. Sampling and test methods. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 22, 225–231.

Paulin JP (2000) Erwinia amylovora: general characteristics, biochemistry and serology. In: Fireblight, the Disease and its Causative Agent, Erwinia amylovora (Ed. Vanneste, J). CAB International, Wallingford (GB). Roselló M, García-Vidal S, Tarín A, Llop P, Gorris MT, Donat V, Peñalver J, Chartier R, Paulin JP, Gardan L & López MM (2002) Characterization of an Erwinia sp. isolated from necrotic pear blossoms in Valencia, Spain. Acta Horticulturae no. 590, 139–142.

Roselló M, Peñalver J, Llop P, Gorris MT, Charter R, Cambra M & López MM (2003) Identification of an Erwinia sp., different from Erwinia amylovora which is responsible for necrosis on pear blossoms. Authors to be contacted (submitted).

Sasser M (1990) Identification of bacteria through fatty acid analysis. In: Methods in Phytobacteriology (Ed. Klement F, Rudolf K & Sands DC), pp. 199–204. Akademiai Kiado, Budapest (HU).

Starr MP, Cardona C & Folsom D (1951) Bacterial fire blight of raspberry.



Phytopathology 41, 951–959.

Thomson SV (2000) Epidemiology of fireblight. In: Fireblight, the Disease and its Causative Agent, Erwinia amylovora (Ed. Vanneste, J). CAB International, Wallingford (GB).

van der Zwet T (2002) Present worldwide distribution of fire blight. Acta

Horticulturae no. 590, 33 –34.

van der Zwet T & Beer S (1995) Fire blight – its nature, prevention and control. A Practical Guide to Integrated Disease Management. USDA Agricultural Information Biuletyn no. 631. Washington (US).

van der Zwet T & Keil HL (1979) Fire blight: a bacterial disease of rosa- ceous plants. USDA Handbook no. 510. Washington (US).



Próba roślin z typowymi objawami (Załącznik II)






Wykonać wstępną diagnozę przez szybkie testy przesiewowe co najmniej 2 testy serologiczne i 1 PCR: (Załącznik III)


Izolacja lub wzbogacona izolacja1


Wszystkie ujemne



1 lub 2 dodatnie

Wszystkie 3 dodatnie


Identyfikacja kolonii o typowej morfologii






Tak

Nie 2




Potwierdzenie przez dwa testy i test biologiczny


Erwinia amylovora nie wykryto




Wykryto Erwinia amylovora

Nie

Tak


Potwierdzono Erwinia amylovora





  1. Patogen jest zwykle łatwo izolowany z materiału roślinnego wykazującego objawy choroby metodą rozcieńczeń płytkowych jak opisano w Załączniku V, czasami może być konieczne wzbogacanie (Załącznik IV).

  2. Hodowla może się nie udać w przypadku prób z materiału roślinnego będącego w zaawansowanym stadium infekcji, z uwagi na konkurencję lub przerośnięcie bakteriami saprofitycznymi. Jeżeli objawy choroby są typowe, a izolacja daje wynik ujemny, wtedy izolacja powinna być powtórzona.

  3. Wykrywanie przy użyciu szybkich testów przesiewowych jest odpowiednie dla rutynowych inspekcji. W przypadku nowych wykryć konieczne jest potwierdzenie przez izolację.

Ryc.3 Schemat wykrywania i identyfikacji

Erwinia amylovora w roślinach żywicielskich

z objawami choroby.




Próba bez objawów chorobowych (Załącznik II)


Ekstrakcja patogenu, koncentracja i wzbogacanie (Załączniki II, III)






Co najmniej 1 test dodatni

Wszystkie testy ujemne

Erwinia amylovora prawdopodobnie wykryta

Izolacja i wzbogacona izolacja (Załączniki IV, V)

Erwinia amylovora nie wykryto

Nie1





Diagnoza wstępna przez szybkie testy przesiewowe; co najmniej 2 (Załącznik III)

Trzy testy dodatnie




Identyfikacja kolonii o typowej morfologii







Tak



Nie


Potwierdzenie przez dwa testy i test biologiczny





Tak



Erwinia amylovora potwierdzono




Ryc. 4 Schemat wykrywania i identyfikacji Erwinia amylovora w próbach bezobjawowych.




1Hodowla może nie udać się w przypadku obecności lub inhibicji przez bakterie saprofityczne. Gdy w testach przesiewowych uzyskano dodatnie wyniki, ale wynik izolacji jest negatywny, należy powtórzyć izolację.





Załącznik I Materiały

Bufory
Bufor fosforanowy 10 mM, pH 7.2 (PBS): NaCl 8 g; KCl 0.2 g; Na2HPO4·12H2O 2.9 g; KH2PO4 0.2 g; woda destylowana do 1 l.

Antyoksydacyjny bufor do maceracji (Gorris et al., 1996a): polyvynilpyrrolidone (PVP-10) 20 g; mannitol 10 g; ascorbic acid 1.76 g; reduced glutathione 3 g; PBS 10 mm pH 7.2-1 l. Doprowadzić pH do 7. Sterylizować przez filtrację.

Bufor węglanowy pH 9.6 : Na2CO3 1.59 g; NaHCO3 2.93 g; Woda destylowana do 1 l. Doprowadzić pH do 9.6.

Bufor do płukania (PBS, pH 7.2–7.4 suplementowany 0.05% Tween 20): NaCl 8 g; KCl 0.2 g; Na2HPO4·12H2O 2.9 g; KH2PO4 0.2 g; Tween 20 500 l; woda destylowana do 1 l.

Bufor substratowy dla alkalicznej fosfatazy: diethanolamine 97 ml; rozpuścić w 800 ml wody destylowanej. Doprowadzić pH do 9.8 za pomocą stężonego HCl. Dopełnić do 1000 ml wodą destylowaną.

Bufor substratowy do strącania dla alkalicznej fosfatazy: Sigma Fast 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium tablets (BCIP-NBT) – Cat No. B-5655 Sigma Aldrich GmbH (Stenheim), Niemcy.

Bufor ekstrakcyjny (Llop et al., 1999): Tris HCl, pH 7.5 24.2 g; NaCl 14.6 g; EDTA 9.3 g; SDS 5 g; polyvinylpyrrolidone PVP-10 20 g; woda destylowana do 1l. Sterylizować przez filtrację.

50X TAE bufor: Tris 242 g; 0.5 M Na2EDTA pH 8.0 100 ml;glacial acetic acid 57.1 ml; woda destylowana do 1 l.

Bufor obciążajacy: Bromophenol blue 0.025 g; glycerol 3 g; woda destylowana do10 ml.
1   2   3   4


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna