34, 155 –157 Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes Europejska I śródziemnomorska Organizacja Ochrony Roślin Normes oepp eppo standardy



Pobieranie 286.24 Kb.
Strona3/4
Data28.04.2016
Rozmiar286.24 Kb.
1   2   3   4

Podłoża
Podłoże CCT (Ishimaru & Klos, 1984): sucrose 100 g; sorbitol 10 g; Niaproof 1.2 ml; crystal violet 2 ml (rozp. 0.1% ethanol); nutrient agar 23 g; woda destylowana do 1 l.

Doprowadzić pH do 7.0–7.2; sterylizować przez autoklawowanie w 115C przez 10 min. Potem przygotować: thallium nitrate 2 ml (1% w/v wodny roztwór); cycloheximide 0.05g (wysoce toksyczny odczynnik, nosić środki ochrony). Sterylizować przez filtrację (0.45 m). Dodać do 1 l sterylnego podłoża (w około 45 C).



Podłoże King B (King et al., 1954): proteose peptone N3

20 g; glycerol 10 ml; K2HPO4 1.5 g; MgSO4 ·7H2O 1.5 g; agar 15 g; woda destylowana do 1 l. Doprowadzić pH do 7.0 –7.2. Sterylizować przez autoklawowanie w 120 C przez 15 min.



Podłoże Lewan: yeast extract 2 g; Bactopeptone 5 g; NaCl 5 g; sucrose 50 g; agar 20 g; woda destylowana do 1 1. Doprowadzić pH do 7–7.2. Sterylizować przez autoklawowanie w 120 C przez 15 min.

Podłoże Ayers (Ayers et al., 1919): NH4H2PO4 1 g; KCl 0.2 g; MgSO4 0.2 g; bromothymol blue 75 ml (roztwór 0.2%); woda destylowana do 1 l. Doprowadzić pH do 7. Sterylizować przez autoklawowanie w 120 C przez 15 min.

Startery
Oligonukleotydowe sekwencje starterów (Bereswill et al., 1992):

Starter A: 5-CGG TTT TTA ACG CTG GG

Starter B: 5-GGG CAA ATA CTC GGA TT

Oligonukleotydowe sekwencje starterów dla nested PCR w pojedynczej zamkniętej probówce (Llop et al., 2000):

Startery zewnętrzne

AJ75: 5-CGT ATT CAC GGC TTC GCA GAT

AJ76: 5-ACC CGC CAG GAT AGT CGC ATA

Startery wewnętrzne

PEANT1: 5-TAT CCC TAA AAA CCT CAG TGC

PEANT2: 5-GCA ACC TTG TGC CCT TTA



Dostępny w handlu standaryzowany materiał kontrolny
Przeciwciała na E. amylovora powszechnie polecane do

wykorzystywania w testach wykrywania i identyfikacji:



  • E. amylovora, poliklonalne, rekomendowane do wykrywania przy użyciu testu IF (walidowane w ring testach), Loewe Biochemica GmbH, Mühlweg 2a, D-82054 Sauerlach (DE).

  • IVIA EPS 1430, poliklonalne, rekomendowane do wykrywania przy użyciu testu IF (zwalidowane w ring testach), Plant Print Diagnostics, S.L., De la March 36, 46512 Faura, Valencia (ES).

  • IVIA Mab 7 A, monoklonalne, rekomendowane do wykrywania przy użyciu testu IF (zwalidowane w ring testach), Plant Print Diagnostics (ES);

  • IVIA Mab 8B + 5H, monoklonalne, rekomendowane do wykrywania przy użyciu testu Wzbogacanej DASI-ELISA (zwalidowane w ring testach), Plant Print Diagnostics (ES).

Uwaga: Po etapie wzbogacania, aby zapobiec wystąpieniu reakcji krzyżowych, rekomendowne jest używanie specyficznych monoklonalnych przeciwciał.

Wzbogacany test DASI-ELISA
Kompletny zestaw oparty o przeciwciała poliklonalne i monoklonalne (8B + 5H IVIA), włącznie z buforem ekstrakcyjnym, półselektywnym podłożem, płytkami do testu ELISA i odczynnikami jest dostępny w: PLANT PRINT Diagnostics, S.L., De la March 36,

46512 Faura, Valencia (ES).



Bezpośredni Tissue print-ELISA
Zestaw oparty o specyficzne monoklonalne przeciwciała, włącznie z pozytywną i negatywną kontrolami, nitrocelulozową membraną, alkaliczną fosfatazą skoniugowaną z przeciwciałami i substratem: PLANT PRINT Diagnostics, S.L., De la March 36, 46512

Faura, Valencia (ES). E-mail: plantprint@nexo.es






Przeciwciała
• Goat antimouse immunoglobulins (znakowane alkaliczną fosfatazą) Sigma, Steinhein (DE);

• Goat antimouse immunoglobulins (znakowane fluoresceiną). Bio-Rad, Marnes-la-Coquette (FR);

• Goat antirabbit immunoglobulins (znakowane fluoresceiną). Bio- Rad, Marnes-la-Coquette (FR).

Załącznik II Przygotowanie prób do testowania
Próby z materiału wykazującego objawy choroby
Próby przetwarzane są w różnych buforach zgodnie z używanymi technikami. Antyoksydacyjny bufor do maceracji (Załącznik I) jest rygorystycznie wymagany dla optymalnego wzbogacenia E. amylovora w materiale roślinnym (Gorris et al., 1996b). Próby mogą być również przetwarzane w sterylnym buforze fosforanowym, pH 7.2 10 mM (PBS) (Załącznik I) lub w sterylnej wodzie destylowanej przy izolacji bezpośredniej, immunofluorescencji lub bezpośredniej PCR.

Uważnie dokonać selekcji części roślin wykazujących najświeższe objawy, z wyciekami, jeśli to możliwe. Z każdego organu wybrać do analizy i obróbki główny brzeg uszkodzenia. Wycieki mogą być poddawane obróbce odrębnie, w 1– 4.5 ml sterylnej wody lub buforu. W przypadku gałązek, pobrać gałązki z objawami, włącznie z liśćmi, na pograniczu pomiędzy nekrotyczną i zdrową tkanką.

W przypadku kwiatów pobrać jeden lub kilka kwiatów z szypułkami. W przypadku liści pobrać jeden lub kilka liści z ogonkami; najlepiej wybierać liście z nekrozami naczyń, ale nie całkowicie znekrotyzowane. W przypadku owoców pobierać jeden lub kilka owoców. Dla łodyg: zdjąć zewnętrzną korę łodygi z objawami choroby używając sterylnego skalpela i pobrać części czyste z typowymi objawami w postaci podkorowych przebarwień. We wszystkich przypadkach, próba powinna składać się z około 0,1g materiału.

Gałązki, kwiaty, liście, łodygi lub owoce pocięte na kawałki umieścić w plastikowych woreczkach. Do każdego woreczka dodać 4.5 ml antyoksydacyjnego buforu do maceracji opisanego przez Gorris et al. (1996a) (Załącznik I). Próby macerować nie mniej niż 5 min. Nieznacznie rozdrobnić materiał roślinny w plastikowych woreczkach z użyciem młotka gumowego lub stomachera firmy Bioreba lub podobnego wyposażenia, zapobiegając rozpryskiwaniu kropel na zewnątrz torebki.

Trzymać próbę na lodzie przez kilka minut, a następnie przenieść 2 ml, 1 ml i 1 ml każdego maceratu do trzech sterylnych probówek Eppendorfa przez dekantację. Jedną próbówkę zawierającą 1 ml każdej próby przechowywać w - 20 ºC dla celu dalszych analiz lub potwierdzenia, a drugą w 30% glicerolu (Difco) w - 80 ºC. Pozostałe na lodzie probówki użyć do przeprowadzenia badań.

Izolacja powinna być wykonana tego samego dnia, co maceracja prób, jak również wzbogacanie i utrwalanie preparatów do immunofluorescencji. Test PCR może być przeprowadzony możliwie najwcześniej, przy wykorzystaniu probówek Eppendorfa przechowywanych w - 20 ºC.



Próby z materiału nie wykazującego objawów
Latem lub wczesną wiosną, po potwierdzeniu sprzyjających rozwojowi choroby warunków, pobrać kwiaty, gałązki, szypułki lub fragmenty łodyg do sterylnych woreczków lub pojemników (van der Zwet & Beer, 1995). W przypadku roślin szkółkarskich: odcinać młode gałązki o długości około 20 cm z dostępnych najbardziej wrażliwych roślin żywicielskich, dezynfekować sekator lub nożyce ogrodnicze pomiędzy roślinami. Jeżeli badanie trzeba przeprowadzić zimą, należy pobrać 5-10 pąków na roślinę. W przypadku roślin rosnących w polu, odcinać kwiaty, gdy są dostępne, i/lub młode gałązki o długości około 20 cm, dezynfekować sekator lub nożyce ogrodnicze pomiędzy roślinami. Z wyselekcjonowanych roślin pobrać kwiaty, lub szypułki i nasadę kilku liści, lub fragmenty łodygi.

Odważyć 0.1–1 g materiału roślinnego i użyć do maceracji w buforze antyoksydacyjnym (Załącznik I) w ilościach jak dla materiału z objawami choroby (powyżej). Próby poddawać obróbce bezpośrednio po wzbogaceniu, po którym następuje test DASI-ELISA i/lub PCR i/lub izolacja, według protokołów opisanych dla prób materiału z objawami choroby. Test IF powinien być wykonany bezpośrednio z ekstraktów, bez wzbogacania.

Procedura fitosanitarna EPPO (OEPP/ EPPO, 1992) zawiera procedurę próbobrania do wykonywania analiz z materiału drzewiastego pędów bez objawów choroby w szkółkach. Próba składa się ze 100 gałązek o długości około 10 cm ze 100 roślin. Jeżeli w partii obecnych jest kilka rodzajów, powinny być one równo reprezentowane w próbie (maksymalnie trzy rodzaje na próbę). Z każdej próby, przypadkowo należy pobrać i pokroić na cztery fragmenty około 30 gałązek (120 części pędów). Umieścić je na 1.5 h na wstrząsarce rotacyjnej w temperaturze pokojowej w sterylnym buforze PBS (Załącznik I) z 0.1% Tween 20 w kolbach Erlenmayera. Filtrować przez bibułę umieszczoną na filtrze ze spiekanego szkła (n◦2 = 40 –100 µm) używając pompy próżniowej i zebrać przesącz. Przesącz użyć bezpośrednio do analizy lub wirować go przez 20 min. w 10.000 g. Osad zawiesić w 4.5 ml sterylnego buforu PBS (Załącznik I).

Podobny protokół może być stosowany dla liści, gałązek, kwiatów lub pąków. W zależności od sezonu inspekcji oczekiwana odzyskiwalność E. amylovora może być zmienna, wysoka w lecie (zapewnione korzystne dla E. amylovora warunki pogodowe) i niska zimą.

Zgodnie z procedurą, jaka będzie zastosowana, przygotować dla każdej próby 3 probówki Eppendorfa z około 2 ml, 1 ml i 1 ml maceratu i użyć go jak podano dla materiału z objawami (powyżej). Bezpośrednia analiza z materiału nie wykazującego objawów choroby daje na ogół wynik negatywny dla E. amylovora, gdy występuje niska populacja bakterii. Stosowne jest wzbogacenie prób (Załącznik IV) w buforze antyoksydacyjnym (Gorris et al., 1996a) (Załącznik I). Podczas badania materiału bez objawów choroby, wzbogacanie powinno być prowadzone przez 72 h w temperaturze około 25 C.

Załącznik III Szybkie testy przesiewowe
Bezpośrednia tissue-print ELISA
Metoda ta może ułatwi postawienie diagnozy wstępnej w materiale wykazującym objawy choroby, ale wymagane są dalsze testy potwierdzające, ponieważ istnieją specyficzne problemy. Metoda może być również wykorzystana w przypadku punktowych kolonii bakterii lub wycieków jako dodatkowy szybki test identyfikacji serologicznej. Wymagane jest użycie przeciwciał o dobrze znanej specyficzności. Istnieje tylko jeden kompletny zestaw bazujący na specyficznych handlowo dostępnych przeciwciałach monoklonalnych, wskazany w Załączniku I.

Do przygotowania odcisku tkanki roślinnej lub plamy (drukowana membrana), powinny być wykonane czyste przecięcia na wykazujących objawy gałązkach, kwiatach, liściach lub szypułkach w polu lub w laboratorium. Świeżo wykonane nacięcia powinny być ostrożnie wtłoczone w membranę nitrocelulozową. Wycieki lub kolonie bakteryjne na podłożu stałym mogą być również drukowane lub nanoszone w postaci plam. Narzędzie do ciecia powinno być dezynfekowane po użyciu, aby zapobiec kontaminacjom. Kontrole pozytywne i negatywne powinny być drukowane, przy użyciu inokulowanych roślin żywicielskich z objawami zarazy ogniowej i roślin zdrowych tego samego gatunku. Odcisk lub druk powinien być zostawiony na kilka minut do wyschnięcia. Z membranami powinno obchodzić się ostrożnie. Zadrukowane membrany powinny być przechowywane przez kilka miesięcy w suchym miejscu w temperaturze pokojowej.

Przygotować roztwór 1% albuminy wołowej (BSA) w wodzie destylowanej (mieszać pałeczką). Umieścić membrany w stosownych pojemnikach (taca, hermetyczny pojemnik, plastikowy worek). Wlać, przykrywając go, roztwór albuminy i inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4C. Nieznaczne mieszanie jest korzystne. Gdy minie czas inkubacji, wylać roztwór albuminy, membranę trzymać w tym samym pojemniku.

Rozcieńczyć w buforze PBS specyficzne na E. amylovora monoklonalne przeciwciała (skoniugowane z alkaliczną fosfatazą) (Załącznik I) do właściwego rozcieńczenia. Wlać roztwór na membranę przykrywając go. Inkubować przez 2–3 godziny z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej i wylać roztwór.

Przygotować bufor do płukania (Załącznik I). Przepłukać membranę i pojemnik buforem do płukania. Płukać przez wytrząsanie (ręczne lub mechaniczne) z dużą ilością buforu przez 5 min.

Usunąć bufor do płukania i powtórzyć operację dwukrotnie. Przygotować bufor substratowy BCIP-NBT (Sigma Fast) (Załącznik I). Wlać powyżej membrany i inkubować aż do czasu pojawienia się purpurowofioletowego zabarwienia w kontroli pozytywnej (w przybliżeniu 10 min.). Zatrzymać reakcję przez płukanie membrany w wodzie wodociągowej. Wysuszyć membranę przez rozłożenie na bibule. Obserwować wydruki przy powiększeniu o małej mocy (X10 lub X20).

Test daje wynik pozytywny, kiedy purpurowofioletowy osad występuje w nacięciach materiału roślinnego i w kontroli pozytywnej, i nie występuje w kontroli negatywnej. Jeśli drukowane są wycieki lub kolonie powinny one zabarwiać się na fioletowo, gdy wynik jest dodatni. Kiedy używa się komercyjnie dostępnego zestawu (Załącznik I), zawiera on zadrukowane membrany kontroli pozytywnej i negatywnej. Test daje wynik negatywny, gdy nie obserwuje się osadu o fioletowym zabarwieniu, podobnie jak w kontroli negatywnej.

Wzbogacany test DASI-ELISA
W handlu dostępny jest tylko jeden zwalidowany w ring testach zestaw do wzbogacanego testu DASI-ELISA (Gorris et al., 1996b). Oparty jest on o przeciwciała monoklonalne i technikę opisaną przez Gorris et al. (1996a,b). Jako kontrole pozytywne używa się wodne ekstrakty prób, które pierwotnie dały w testach negatywne wyniki, zmieszane z zawiesiną bakterii o gęstości około 108 komórek E. amylovora w mililitrze. Jako kontrole negatywne wykorzystuje się ekstrakty prób, dla których otrzymano wyniki negatywne testów na E. amylovora i zawiesinę w buforze PBS izolatu bakterii nie będącego E. amylovora (Załącznik I).

Gotować potrzebną ilość wzbogaconych ekstraktów i kontrole w łaźni wodnej ( lub w termobloku) w 100º C przez 10 min przed testem ELISA, mieć pewność, że próbówki nie otworzyły się podczas gotowania. Pozostały po wzbogaceniu ekstrakt prób przechowywać w celu izolacji i/lub testu PCR. Poddać testowi ELISA gotowane próby (raz w temperaturze pokojowej) tego samego dnia lub zamrozić je w -20ºC w celu późniejszych analiz. Proces gotowania jest konieczny w celu uzyskania optimum czułości i specyficzności przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, zgodnie z Gorris et al. (1996a).

Przygotować stosowne rozcieńczenia poliklonalnych przeciwciał króliczych w buforze węglanowym, pH 9.6 (Załącznik I). Do każdej studzienki płytki ELISA Nunc Polysorp (lub równoważnej) dodać 200 µl przygotowanych przeciwciał. Inkubować w 37ºC przez 4 h lub w 4 ºC przez 16 h. Wypłukać studzienki płytki trzy razy w buforze do płukania (Załącznik I). Do każdej studzienki dodać 200 µl maceratu roślinnego wzbogaconego wcześniej w dwóch rodzajach podłoży i zagotowanego. Dla jednej próby użyć dwie studzienki płytki na każdy rodzaj podłoża, i po dwie dla kontroli pozytywnej i negatywnej. Konieczne jest również umieszczenie kontroli negatywnej używanego buforu ekstrakcyjnego i wzbogaconego podłoża (przygotowanego wcześniej, jako dodatkowe kontrole negatywne wzbogacania). Inkubować przez 16 h w 4ºC. Wypłukać studzienki trzy razy buforem do płukania (jak wyżej).

Przygotować odpowiednie rozcieńczenie specyficznych przeciwciał monoklonalnych na E. amylovora (Załącznik I) w buforze PBS z dodatkiem 0.5% albuminy wołowej (BSA) i dodać do każdej studzienki po 200 l. Inkubować w 37 C przez 2 h. Wypłukać płytkę w buforze PBS Tween trzy razy. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie koniugatu z alkaliczną fosfatazą (Sigma) (Załącznik I) w buforze PBS. Dodać 200 l do każdej studzienki. Inkubować w 37C przez 2 h. Wypłukać studzienki trzy razy jak wyżej. Przygotować 1 mg ml1 substratu alkalicznej fosfatazy (p-nitrofenylofosfat) w buforze substratowym (Załącznik I). Dodać 200 µl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej i odczytać w 405 nm po 30, 45, i 60 minutach. Test ELISA jest negatywny, jeżeli wartość optycznej gęstości (OD) odczytana w studzienka będących powtórzeniami prób jest < 2x OD od wartości optycznej gęstości w próbie negatywnej kontroli ekstraktu (pod warunkiem, że wartość gęstości optycznej OD dla kontroli pozytywnej jest powyżej 1.0 po 60 minutach inkubacji i jest wyższa niż dwukrotna wartość gęstości optycznej w odniesieniu do ekstraktu próby negatywnej). Test ELISA jest pozytywny, jeżeli wartość gęstości optycznej odczytana ze studzienek bodących powtórzeniami próby jest > 2x OD niż wartość gęstości optycznej ekstraktu próby negatywnej i dwukrotnie wyższa niż wartość gęstości optycznej OD odczytana we wszystkich studzienkach kontroli negatywnej i niższa od wartości w studzienkach kontroli pozytywnej. Negatywny odczyt testu ELISA dla studzienek kontroli pozytywnej wskazuje na niewłaściwe przeprowadzenie testu i nieodpowiednie przygotowanie odczynników. Pozytywny odczyt testu ELISA w studzienkach kontroli negatywnej świadczy o wystąpieniu reakcji krzyżowych lub niespecyficznym wiązaniu koniugatu. W obu przypadkach test powinien zostać powtórzony lub należy wykonać drugi test oparty o inną zasadę biologiczną.



Bezpośredni test ELISA
Użyć 200 µl wodnej zawiesiny czystej kultury podejrzanego izolatu (po uprzednim poddaniu go gotowaniu w 100 ºC przez 10 minut w łaźni wodnej lub w bloku grzejnym w celu zredukowania reakcji niespecyficznych). Dodać odpowiednią ilość buforu węglanowego (Załącznik I). Zastosować 200 µl zawiesiny wodnej do co najmniej dwóch studzienek płytki Nunc-Polysorp lub równoważnej. Jako kontrolę pozytywną użyć zawiesinę bakterii o gęstości około 109 komórek w mililitrze z czystej kultury E. amylovora a jako kontrolę negatywną podobną zawiesinę innego gatunku bakterii. Inkubować przez 1 h w 37ºC lub przez noc w 4ºC. Wytrząsnąć ekstrakty ze studzienek. Wypłukać studzienki trzy razy buforem do płukania (Załącznik I), ostatni roztwór płuczący pozostawić w studzienkach na co najmniej 5 minut.

Przygotować odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał przeciwko E. amylovora używając zalecanych rozcieńczeń dla handlowo dostępnych przeciwciał (Załącznik I). Dodać 200 µl do każdej studzienki i inkubować przez 1 h w 37 C. Wytrząsnąć roztwór przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie koniugatu dla alkalicznej fosfatazy (GAM-AP) (Załącznik I) w buforze PBS + 0.5% BSA. Dodać 200 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 h w 37C. Wytrząsnąć koniugat ze studzienek jak poprzednio. Przygotować 1 mg ml1 substratu dla alkalicznej fosfatazy (p-nitrofenylofosfat) w buforze substratowym (Załącznik I). Dodać 200 l roztworu substratu alkalicznej fosfatazy do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej i odczytać w 405 nm w regularnych odstępach w ciągu 90 minut.



Immunofluorescencja (IF)
Wykonywać zgodnie z standardowym protokołem opisanym w UE (1998). Używać zwalidowanych przeciwciał na E. amylovora. W ring testach poddano walidacji trzy komercyjnie dostępne rodzaje przeciwciał. Dla każdej nowej partii przeciwciał zalecane jest wyznaczenie miana i rozcieńczeń roboczych. Test IF powinien być prowadzony na świeżo przygotowanych ekstraktach prób. Jeżeli wykorzystywane będą ekstrakty przechowywane w - 80 ºC pod glicerolem należy usunąć glicerol przez dodanie 1 ml buforu PBS (Załącznik I), wirowanie przez 15 minut z przyspieszeniem 7000 g, wyrzucenie supernatantu i zawieszenie osadu w buforze PBS.

Dla każdego zestawu testów przygotować preparat kontroli pozytywnej używając zawiesiny bakterii znanej kultury E. amylovora o gęstości około 106 komórek w mililitrze. W przypadku wykonywania badań zakrojonych na większą skalę zalecane jest dołączenie preparatów ślepych kontroli pozytywnych.. Użyć bufor PBS a jako kontrole negatywne wodne negatywne ekstrakty prób, które przebadane wcześniej kilkoma technikami dały wyniki negatywne.

Do nanoszenia na okienka szkiełka do IF używać nie rozcieńczonych maceratów i ich rozcieńczeń 1:10 i 1:100 w buforze PBS (Załącznik I). Dla każdej próby przygotować jeden preparat z rozcieńczeniami. Preparaty pozostawić do wysuszenia na powietrzu i utrwalić przez opalenie lub w alkoholu absolutnym lub 95% etanolu zgodnie z charakterystyką używanych przeciwciał. Preparaty przechowywać w - 20 ºC. Użyć przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych w odpowiednich rozcieńczeniach w buforze PBS (Załącznik I). Nanosić po 25 –30 µl na okienko. Preparaty inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zaleca się używanie dwóch rozcieńczeń przeciwciał w przypadku stosowania przeciwciał poliklonalnych, w celu wykrycia reakcji krzyżowych z innymi bakteriami. Strzepnąć krople z preparatów i ostrożnie wypłukać preparaty w buforze PBS w (Załącznik I). Płukać 10 minut używając tego samego buforu. Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci.

Rozcieńczyć odpowiedni koniugat FITC w buforze PBS: przeciw mysim przeciwciałom w przypadku przeciwciał monoklonalnych (GAM-FITC) (Załącznik I) i przeciw króliczym przeciwciałom (GAR-FITC) (Załącznik I) lub przeciw kozim przeciwciałom (Załącznik I). Pokryć okienka wszystkich preparatów odpowiednim rozcieńczeniem koniugatu i inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć etap płukania. Nanieść pipetą 5–10 µl 0.1 M fosforanowo-glicerynowego buforu zapobiegającego wygaszaniu fluorescencji (0.5% p- fenylenodiamina lub inny) na każde okienko i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Oglądać preparaty pod imersją w powiększeniu 500–1000 razy przez przejrzenie okienek w poprzek dwóch średnic pod kątem prostym i wokół obwodu. Przeliczyć liczbę komórek na 1 mililitr próby, zgodnie z UE (1998).

Wynik testu jest negatywny, jeżeli w kontroli pozytywnej obserwuje się zielono fluoryzujące komórki o typowej dla E. amylovora morfologii, ale nie ma ich w okienkach prób. Wynik testu jest pozytywny, gdy zielono fluoryzujące komórki o typowej morfologii obserwowane są w kontroli pozytywnej i okienkach prób, ale nie są obecne w okienkach kontroli negatywnej. Populacja 103 komórek na mililitr jest uważana za granicę wiarygodności w teście IF, dla prób z > 103 komórek w mililitrze, test IF uważany jest za dodatni. Dla prób o gęstości < 103 komórek w mililitrze, wynik testu IF może być uważany za wątpliwy. W takim przypadku następne testy lub powtórne próbobrania powinny być przeprowadzone. Próby z duża liczbą niecałkowicie lub słabo fluoryzujących komórek w porównaniu do kontroli pozytywnej wymagają przeprowadzenia dalszych testów, w oparciu o inne rozcieńczenia przeciwciał lub osadu lub o przeciwciała pochodzące z innego źródła.

PCR
Używać zwalidowanych odczynników do PCR i protokołów. Przedsięwziąć wszelkie środki ostrożności zapobiegające kontaminacji prób. Używać dwóch pozytywnych kontroli z wodnymi ekstraktami próby tego samego żywiciela (który dał wcześniej wynik negatywny testu) o gęstości 104 i 106 komórek w mililitrze dodanego znanego szczepu E. amylovora i zawiesiny 104 komórek mililitrze izolatu E. amylovora. Kontrole pozytywne przygotować w laboratorium oddzielonym od tego, gdzie będą testowane próby. Jako kontrolę negatywną użyć co najmniej jeden ekstrakt próby, która wcześniej dała wynik negatywny w badaniu na obecność E. amylovora z wykorzystaniem kilku technik i próby zawierające ultra czystą wodę (odczynnik do PCR). Jeżeli podejrzewa się kontaminację, do każdego etapu ekstrakcji DNA i amplifikacji należy dołączyć więcej kontroli negatywnych.

Ekstrakcję DNA z kontroli pozytywnej i negatywnej przeprowadzać w sposób taki sam jak z prób.

Dostępny jest jeden protokół ekstrakcji DNA z prób roślin (Llop et al., 1999) i dwa protokoły amplifikacji (Bereswill et al.,1992 i Llop et al., 2000), które zwalidowane zostały w ring testach. Dostępnych jest kilka komercyjnych zestawów do ekstrakcji DNA, ale nie były one poddane walidacji.
Ekstrakcja DNA
Pobrać bezpośrednio 1 ml każdego maceratu i/lub 1 ml wzbogaconych maceratów, a następnie postępować zgodnie z protokołem ekstrakcji DNA wg Llop et al. (1999). Maceraty wirować w 13.000 obrotów na minutę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatantu, a osad zawiesić w 500 l buforu do ekstrakcji (Załącznik I) i wytrząsać przez 1 h w temperaturze pokojowej. Probówki wirować w 5.000 obrotów na minutę przez 5 minut. Pobrać 450 l supernatantu umieścić go w nowej probówce Eppendorfa. Dodać taką samą objętość izopropanolu, odwrócić kilka razy pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 h. Wirować w 13.000 obrotów na minutę przez 5 minut, wyrzucić supernatant i wysuszyć na stole w temperaturze pokojowej. W przypadku obecności zabarwienia osadu w górnej części probówki (brązowe lub zielone) ostrożnie pobrać całość supernatantu, i tak otrzymać czyste DNA. Na ogół, DNA przyczepia się do ścianek probówki bardziej niż do dna. Osad zawiesić w 200 µl wody. Do reakcji PCR użyć 5 lub 1 µl w zależności od rodzaju amplifikacji, która będzie wykonywana.

1   2   3   4


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna