34, 155 –157 Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes Europejska I śródziemnomorska Organizacja Ochrony Roślin Normes oepp eppo standardy



Pobieranie 286.24 Kb.
Strona4/4
Data28.04.2016
Rozmiar286.24 Kb.
1   2   3   4

Amplifikacja
W celu wykrywania i identyfikacji E. amylovora opisano wiele starterów i protokołów reakcji PCR. Większość z nich może być używana do specyficznej identyfikacji (Bereswill et al., 1992; Bereswill et al., 1995; Guilford et al., 1996;McManus & Jones, 1995). W przypadku niektórych mogą pojawić się specyficzne problemy, jak np. dla starterów wg Maes et al. (1996), które amplifikują Erwinia sp. izolowane ze znekrotyzowanych kwiatów gruszy i inne z E. amylovora (Roselló et al., 2002). Walidacji podlegały startery i protokoły wg Bereswill et al. (1992) i Llop et al. (2000), ponieważ były one uznane za bardziej czułe i silne w konwencjonalnych reakcjach PCR ze sztucznie skontaminowanym materiałem roślinnym we wstępnych doświadczeniach . Niemniej jednak, analiza PCR wg Guilford et al. (1996) lub McManus & Jones (1995) jest również odpowiednia, w tym wypadku do testowania zawiesin bakteryjnych..

Konwencjonalny PCR

Zwalidowany konwencjonalny (lub pojedynczy) PCR wykorzystuje startery i warunki opisane przez Bereswill et al. (1992). Sekwencje starterów są następujące (Załącznik I):

Starter A: 5-CGG TTT TTA ACG CTG GG

Starter B: 5-GGG CAA ATA CTC GGA TT

Skład mixu do PCR jest następujący: woda (PCR czystość) 20 l; bufor10  5 l; MgCl2 50 mM 1.5 l; dNTPs 10 mM 1 l; 2- merkaptoetanol 1.4 l; albumina wolowa 1 g l18 l; DMSO 2.5 l; Tween 20 0.5 l; Starter A 10 pmol l12.5 l; Starter B 10 pmol l1 2.5 l; Tth po 5 Ul1 0.1 l. Objętość próby: dodać 5 l to 45 l mixu.

Warunki reakcji: denaturacja 93 C przez 2 minuty, następnie 37 cykli w 93 C przez 1 min, 52 C przez 2 min, i 72 C przez 2 min. Etap końcowy w 72 C przez 10 minut kończący reakcję. Amplikon ma wielkość 900 bp zgodnie z Bereswill et al. (1992), aczkolwiek możliwe są różnice w wielkości amplikonu między 900 a 1100 bp (Lecomte et al., 1997), przy liczbie 8 par zasad sekwencji repetytywnych we fragmencie. (Jones & Geider, 2001).

Prostszy mix do PCR daje takie same rezultaty jak oryginalny: woda (PCR czystość) 33.1 l; bufor 10  5 l; MgCl2 50 mM 3 l 3 mM; formamid 2 l 4% (v/v); dNTPs 10 mM 0.5 l; Starter A 10 pmol l1 0.5 l; Starter B 10 pmol l1 0.5 l; Taq polimeraza 5 U l1 0.4 l. Objętość próby: dodać 5 l do 45 l mixu.

Warunki reakcji: denaturacja w 93 C przez 5 minut następnie 40 cykli w 93 C przez 30 s, 52 C przez 30 s, i 72 C przez 1 minutę 15 s. Etap końcowy w 72 C przez 10 min kończący reakcję. Pojedyncze składniki mixu mogą być zastąpione przez Ready Mix Taq z MgCl2 lub Ready Mix Red Taq PCR Reaction Mix with MgCl2 (Sigma).



Nested PCR
Nested PCR w jednej probówce (Llop et al., 2000) z wykorzystaniem dwóch par starterów dodawanych w tym samym czasie. Z powodu ich różnych temperatur anilingu, te dwie reakcje PCR przebiegają kolejno. Startery zewnętrzne wg McManus & Jones (1995), natomiast startery wewnętrzne wg Llop et al. (2000). Sekwencje starterów są następujące (Załącznik I):

Startery zewnętrzne

AJ75: 5’-CGT ATT CAC GGC TTC GCA GAT

AJ76:5’-ACC CGC CAG GAT AGT CGC ATA

Startery wewnętrzne

PEANT1: 5-TAT CCC TAA AAA CCT CAG TGC

PEANT2: 5-GCA ACC TTG TGC CCT TTA

Skład mixu do PCR jest następujący: woda (PCR czystość) 34.76 l; Bufor 10  5 l; MgCl2 50 mM 3 l; formamid 2 l; dNTPs 10 mM 1 l; Starter AJ75 0.1 pmol l1 0.32 l; Starter AJ76 0.1 pmol l1 0.32 l; PEANT1 10 pmol l1 1 l; PEANT2 10 pmol l1 1 l; polimeraza 5 U l1 0.6 l. Objętość próby: dodać 1 l do 49 l PCR mixu.

Warunki reakcji: denaturacja w 94 C przez 4 minuty następnie 25 cykli w 94 C przez 30 s i 72 C przez 1 minutę. Produkty pierwszej reakcji PCR poddawane sa w tym samym amplifikatorze następnej denaturacji w 94 C przez 4 minuty i 40 cyklom w 94 C przez 30 s, 56 C przez 30 s, i 72C przez 45 s. Etap końcowy w 72 C przez 10 minut kończący reakcję. Wielkość amplikonu wynosi 391 bp, aczkolwiek mogą wystąpić pewne odchylenia.

Warunki reakcji zoptymalizowane zostały dla aparatu Perkin- Elmer 9600, niewielkie modyfikacje protokołu mogą być konieczne dla innych amplifikatorów.

Gdy PCR wykonywany jest w celu potwierdzenia wyizolowanych kolonii, używa się 1 U Taq polimerazy wg protokołu zaproponowanego przez Bereswill et al. (1992) lub 2 U wg Llop et al., 2000) (zamiast 2 lub 3 U jak dla materiału roślinnego).

Elektroforeza
Po każdej reakcji PCR przygotować żel agarozowy 1.5% w buforze TAE 0.5 X (Załącznik I). Umieścić 3 l krople buforu obciążającego na parafilmie (Załącznik I), zmieszać 20 l produktu PCR delikatnie przez zasysanie pipetą przed nałożeniem. Wypełnić kieszonki żelu i dołączyć kontrole pozytywną i negatywną. Dołączyć marker DNA 100 bp ladder umieszczając go w pierwszej i ostatniej kieszonce żelu. Rozwijać elektroforezę przez 20 minut w 120 V (średni stolik: 15  10 cm) lub 40 minut w 160 V (duży stolik lub komora elektroforetyczna: 15  25cm). Moczyć żel w roztworze bromku etydyny przez 20 minut. Dokonać wizualizacji zamplifikowanych fragmentów DNA w UV transiluminatorze.

Amplikony otrzymane ze starterami wg Bereswill et al. (1992) i amplikony otrzymane w reakcji nested PCR prowadzonej w jednej probówce wg (Llop et al., 2000) mogą być poddane działaniu endonukleaz Dra I i Sma I i uzyskane fragmenty restrykcyjne wykorzystane do potwierdzenia analizy PCR.



Interpretacja wyników testu PCR
Wynik testu PCR jest ujemny, jeżeli specyficzny dla E. amylovora o przewidywanej wielkości fragment restrykcyjny nie został wykryty dla próby, ale jest wykrywany we wszystkich próbach kontroli pozytywnych. Wynik testu PCR jest dodatni, jeżeli specyficzny o przewidywanej wielkości amplikon został wykryty, pod warunkiem, że nie jest on amplifikowany z żadnej próby kontroli negatywnej i fragmenty restrykcyjne są identyczne jak dla kontroli pozytywnej szczepu. Jeżeli w jednej z kontroli negatywnych stwierdza się obecność prążka o rozmiarze oczekiwanym dla E. amylovora, należy powtórzyć reakcję PCR z nowym mixem i dołączyć kilka kontroli negatywnych, które wykryją kontaminację. Wiarygodne potwierdzenie pozytywnego wyniku może być uzyskane przez powtórzenie testu z drugim zestawem starterów. Inhibicję PCR podejrzewa się wtedy, gdy oczekiwany amplikon jest wykrywany w próbie kontroli pozytywnej zawierającej E. amylovora w wodzie, a wyniki negatywne są otrzymywane z próby kontroli pozytywnej izolatu E. amylovora w ekstrakcie roślinnym.

Załącznik IV Wzbogacanie
Wzbogacanie jest stosowane w celu namnożenia pierwotnej populacji bakterii E. amylovora w próbie. Jest ono niezbędne przed wykrywaniem testem ELISA, z powodu niskiego poziomu czułości tej techniki podczas używania specyficznych monoklonalnych przeciwciał. Powinno być ono wykonane również przed izolacją lub przed PCR (nawet w próbach bezobjawowych), kiedy spodziewana jest niska liczebność w hodowli E. amylovora (zabiegi miedziowe prób, stare objawy, niekorzystne warunki pogodowe dla zarazy ogniowej, zima, itp.) lub w przypadku podejrzewania wysokiej liczby inhibitorów. W sytuacjach, gdy nieznany jest zróżnicowanie i liczebność populacji mikroorganizmów należy używać dwóch zwalidowanych podłoży, jednego nieselektywnego (King B) i jednego półselektywnego (CCT) (Załącznik I).

Wkrótce po przygotowaniu maceratów (Załącznik II), rozlać 0.9 ml każdej próby do dwóch sterylnych 3–5 ml probówek z przygotowaną taką samą objętością każdego wzbogaconego podłoża. Dodatkowo przygotować trzy probówki z 0.9 ml buforu do maceracji, jako kontrole negatywne (Załącznik I) i dodać taką samą objętość buforu i każdego wzbogaconego podłoża (CCT i King B sterylne podłoża płynne) (Załącznik I). Inkubować w temperaturze 25 C przez 48 h bez wytrząsania. W przypadku, gdy spodziewana jest niska liczebność E. amylovora inkubować przez 72 h, jak wskazano powyżej.



Załącznik V Izolacja
Izolacja bezpośrednia
Użyć podłoża CCT, King B i Lewan (lub Nutrient Agar Sucrose) (Załącznik I). Przygotować rozcieńczenia 1: 10 i 1: 100 każdego maceratu (Załącznik II) w PBS (Załącznik I). Nanieść 50 l rozcieńczonych i nierozcieńczonego maceratu na dwie osobne płytki każdego podłoża. Rozpocząć od rozcieńczenia 1:100 i przechodzić do nierozcieńczonego maceratu. Używać sterylnych ez lub głaszczki lub zanurzanej w etanolu szklanej szpatułki, opalanej i następnie studzonej. Ostrożnie rozprowadzać naniesioną objętość przez trzykrotne rozgłaskanie. Wykonać rozcieńczenia 103, 104 i 105 cfu ml1 czystej kultury E. amylovora jako kontrolę jakości podłoży. Płytki inkubować w temperaturze około 25 C przez 48 –72 h. Końcowy odczyt wykonywany jest po 72–96 h.

Kolonie E. amylovora na podłożu CCT pojawiają się po około 48 h i są bladofioletowe, okrągłe, wysoko wypukłe do kopulastych, gładkie i mukoidalne po 72 h, wykazujące powolniejszy niż na podłożu King B i Lewan wzrost. Podłoże CCT hamuje rozwój większości pseudomonad, ale nie Pantoea agglomerans. Kolonie E. amylovora na podłożu King B pojawiają się po 24 h i są one kremowobiałe, okrągłe, z tendencją do rozprzestrzeniania się i nie fluoryzujące w świetle UV przy 366 nm po 48 h. Pozwala to na odróżnienie od fluoryzujących pseudmonad. Kolonie E. amylovora na podłożu Lewan pojawiaja sie po 24 h I są białawe, okrągłe, kopulaste, gładkie I mukoidalne po 48 h. Kolonie lewan ujemne E. amylovora mogą również być notowane (Bereswill et al., 1997). Uzyskać czystą kulturę przez posiew pojedynczych podejrzanych kolonii z każdej próby na podłoże King B. Domniemane kolonie Erwinia amylovora zidentyfikować przez inokulację dostępnych żywicieli E. amylovora, przez DASI-ELISA lub PCR, lub w drodze innego testu (testy biochemiczne, IF, profil kwasów tłuszczowych, itp.) jak jest to wskazane. Kultury przechowywać na skosach z agarem odżywczym pod warstwą oleju mineralnego 10 C lub w celu dłuższego przechowywania w 30% glicerolu w 80 C lub zliofilizować.

Wynik izolacji jest negatywny, jeżeli po 96 h inkubacji w żadnym z trzech podłoży nie obserwowano kolonii bakteryjnych o morfologii podobnej do E. amylovora (pod warunkiem że nie podejrzewa się inhibicji z powodu konkurencji lub antagonizmu) a typowe dla E. amylovora kolonie zostały znalezione w kontroli pozytywnej. Wynik izolacji jest pozytywny, jeżeli domniemane kolonie E. amylovora zostały wyizolowane na co najmniej jednym rodzaju używanego podłoża i zidentyfikowane przez potwierdzenie jedną z wskazanych metod.

Wzbogacona izolacja
Posiać wzbogacenia tylko na płytki z podłożem CCT (Załącznik I). Rozprowadzić 50 µl każdego wzbogaconego ekstraktu i rozcieńczenia 1:10, 1: 100, 1:1000 przygotowane w buforze PBS (Załącznik I) przez trzykrotne rozgłaskanie (jak przy izolacji), w celu uzyskania odizolowanych kolonii. Inkubować w temperaturze około 25ºC przez 72-96 h. Zaleca się używać tylko podłoża półselektywnego i rozcieńczeń, z uwagi na obfite namnażanie się różnych bakterii podczas etapu wzbogacania.

Załącznik VI Test biologiczny
Inokulacja szypułek (wrażliwych odmian gruszy, jabłoni lub niesplika japońskiego) może być przeprowadzana na zupełnie dojrzałych owocach lub na ich plastrach przy użyciu zawiesiny bakterii o gęstości 109 jednostek tworzących kolonie ml1 w buforze PBS (Załącznik I). Należy dołączyć kontrole pozytywną i negatywną, jak wskazano powyżej. Inkubować w wilgotnej komorze w 25C przez 3–5 dni. Test jest pozytywny, gdy owoce wykazują zbrązowienia wokół miejsc zranienia i wydziela się śluz bakteryjny w ciągu 3 –7 dni (akceptowane jest, że kontrola negatywna daje tylko nekrotyczne obszary).

W przypadku inokulacji całych roślin, używać odmian wrażliwych gruszy, jabłoni lub niesplika japońskiego, lub wrażliwych gatunków Crataegus, Cotoneaster lub Pyracantha. W celu inokulacji roślin doniczkowych, nożem zanurzanym w zawiesinie bakterii każdej testowanej kolonii w buforze PBS o gęstości około 109 komórek w mililitrze ciąć młode liście na młodych gałązkach w kierunku głównego unerwienia (Załącznik I). Odcinane młode gałązki z rosnących w szklarni roślin mogą być inokulowane tym samym sposobem, po dezynfekcji przez 30 s 70% etanolem i 3 trzykrotnym płukaniu sterylną destylowaną wodą, i trzymane w próbówkach ze sterylnym 1% agarem. Rośliny utrzymywać w 20–25 C przy wilgotności względnej 80 –100% a probówki w 20–25C przy 16 godzinach światła. Wyniki odczytać po 3, 7 i 15 dniach. Typowe objawy powodowane przez E. amylovora to więdnięcie, przebarwienia, nekrozy tkanki i wycieki śluzu.









A B







C D
Fig. 1 A: Objawy zarazy ogniowej na kwiatach gruszy (M. Cambra, IVIA, Hiszpania); B: Objawy zarazy ogniowej na pędach jabłoni

(M.A.Cambra, D.G.Aragón, Hiszpania); C: Zrakowacenia powodowane przez E. amylovora na pniu gruszy (M. Cambra, IVIA, Hiszpania); D: Objawy zarazy ogniowej na pędach gruszy (M.M.López, IVIA, Hiszpania)







A B






C




D


Fig. 2 A: Objawy E. amylovora na Pyracantha (M.M.López, IVIA, Hiszpania) ; B: Inokulacja oderwanych liści pędów gruszy: po lewej kontrola negatywna, po prawej, E. amylovora (P. Llop, IVIA, Hiszpania); C: Objawy E. amylovora zawiązkach owocowych gruszy po inokulacji (V. Donat, IVIA, Hiszpania); D: Kolonie E. amylovora na podłożu CCT (M.M.López, IVIA, Hiszpania).

1


2J. Janse, Plant Protection Service, Wageningen, NL; M. Keck, Bundesamt und Forschungszentrum für Landwirtschaft, Vienna, AT; A. Sletten, Plant Protection Centre, Ås, NO; M. A. Cambra, Centro de Protección Vegetal, Zaragoza, ES; J. L. Palomo, Centro Regional de Diagnóstico, Aldearrubia Salamanca, ES; S. Simpkins, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, GB; T. T. Duarte, Direcção Geral de Protecção das Culturas, Lisbon, PT; F. Poliakoff, LNPV Unité Bactériologie, Angers, FR; J. Van Vaerenbergh, Rijkstation voor Plantenziekten, Merelbeke, BE; M. M. López, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Valencia, ES.

1   2   3   4


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna