Analiza chromatograficzna Fitohormonów Wstęp



Pobieranie 27.36 Kb.
Data29.04.2016
Rozmiar27.36 Kb.

Analiza chromatograficzna Fitohormonów

Wstęp

Chromatografia jest metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. Fazą ruchomą może być gaz lub ciecz, a fazą nieruchomą ciało stałe lub ciecz. Jeśli fazą ruchomą jest gaz, to chromatografia nosi nazwę gazowej, gdy zaś fazą ruchomą jest ciecz to chromatografia taka nazywana jest cieczową.

Analizę techniką chromatografii gazowej (GC, Gas Chromatography) wykonuje się zazwyczaj w stosunkowo wysokich temperaturach, umożliwiających odparowywanie nawet substancji stałych. W chromatografie gazowym, że gaz nośny ze zbiornika pod ciśnienie płynie do specjalnie skonstruowanego, umożliwiającego wstrzykiwanie próbek, dozownika a następnie, już razem z próbką przez kolumnę do detektora. Temperatura dozownika, kolumny i detektora jest regulowana i może wynosić nawet 350 oC. Próbkę w postaci gazu, cieczy lub ciekłego roztworu ciała stałego wprowadza się do dozownika mikrostrzykawką lub specjalnym zaworem dozującym (głównie gazy). Próbka w dozowniku zostaje przeprowadzona w stan gazowy (odparowana w wysokiej temperaturze) i ze strumieniem gazu nośnego przeniesiona do kapilarnej kolumny o długości 20-30 metrów, gdzie następuje rozdzielanie składników próbki. Rozdzielone składniki trafiają kolejno do detektora, generując w nim odpowiedni sygnał, który po wzmocnieniu rejestrowany jest w postaci pików (chromatogramu) (patrz Rysunek 2.1).

C
hromatografię gazową substancji gazowych i lotnych rozpuszczalników przeprowadza się w niezmienionej postaci, jednakże w celu przeprowadzenia analizy organicznych substancji stałych i nielotnych rozpuszczalników anality należy przeprowadzić w odpowiednie pochodne (derywatyzować). Lotność substancji zwiększa się poprzez zablokowanie ich polarnych grup funkcyjnych (-COOH, -OH, NH2). Derywatyzację przeprowadza się także w celu zwiększenia trwałości termicznej analizowanych substancji. W przypadku analizy kwasów karboksylowych, alkoholi, fenoli i amin najczęściej stosowaną metodą derywatyzcji jest metylacja i/lub sililacja.



Zastosowanie chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią masową (GC-MS) w analizie fitohormonów

W analizie związków organicznych szerokie zastosowanie znajduje spektrometr masowy sprzężony z chromatografem gazowym, który pozwala m.in. uzyskać jakościowe informacje o rozdzielanych związkach oraz zapewnia specyficzność oznaczeń ilościowych.

Podstawowymi elementami spektrometru masowego są: układ wprowadzania próbek (w przypadku GC-MS jest to chromatograf gazowy), źródło jonów, analizator kwadropulowy lub pułapka jonów, powielacz elektronowy pełniący funkcję detektora oraz system przetwarzania danych.

Analizowane związki bombardowane są elektronami w źródle jonów. W wyniku wybicia elektronu powstają jony wzbudzone, które z kolei mogą ulegać dalszym przemianom, jak przedstawiono na schemacie:

ABC + e-  ABC+* + 2e- (tworzenie jonu)

ABC+*  AB+ + C* ; AB+  A+ + B (fragmentacja)

ABC+*  BC+ + A *

ABC+*  AC+ + B* (fragmentacja z przegrupowaniem)


Rodzaj powstałych jonów oraz ich względne proporcje są charakterystyczne dla poszczególnych substancji i stanowią podstawę do ich identyfikacji. Wytworzone jony trafiają do analizatora mas, który działa jak filtr - przepuszcza do detektora po kolei jony o zadanym stosunku masy do ładunku (m/z), co pozwala zarejestrować widmo masowe.

W analizie GC-MS spektrometr masowy spełnia dwie funkcje: rolę detektora chromatografu gazowego (rejestruje tzw. prąd jonowy) oraz rejestruje widma masowe co pozwala na identyfikację analitu. Dzięki analizie wyselekcjonowanych jonów (SIM) z zastosowaniem deuterowanych pochodnych można przeprowadzać oznaczenia ilościowe badanych substancji.


Literatura: E. De Hoffmann i wsp. Spektrometria mas. WN-T. Warszawa 1998.


ćwiczenia





  1. Analiza jakościowa auksyn metodą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrii mas (GC-MS). Porównanie widm masowych i czasów retencji IAA i IBA.

Przygotować po 10 ml metanolowego roztworu kwasu indolilooctowego (IAA) i kwasu indolilomasłowego (IBA) o stężeniu 1 mg/ml. Z przygotowanych w ten sposób roztworów pobrać po 0.05 ml roztworu i przenieść do naczyniek reakcyjnych oznaczonych odpowiednio jako IAA oraz IBA. Do trzeciego naczyńka oznaczonego jako MIX dodać po 0.05 ml każdego z przygotowanych roztworów. Zawartość naczyniek wysuszyć przez ok. 5 min strumieniem azotu w temp. 60oC i do każdego dodać po ok. 1 ml odczynnika derywatyzującego (eterowy roztwór diazometanu) – dodawanie odczynnika oraz wszystkie dalsze z nim manipulacje przeprowadzamy BEZWZGLĘDNIE pod włączonym wyciągiem (dygestorium). Naczyńka reakcyjne szczelnie zakręcamy, wytrząsamy przez okres około 1 min i pozostawimy na okres 5 min w spokoju. Po tym czasie eter odparowujemy w strumieniu azotu i do każdego z naczyniek dodajemy po 0.5 ml metanolu do GC. Tak uzyskane próbki poddajemy analizie chromatograficznej wg. zaprogramowanej wcześniej metody chromatograficznej (temperatury, szybkości przepływu gazów, itp) na kolumnie SE-54, 30m/0.32 mm/ 0.25 m.

Analizę prób przeprowadzamy wstrzykując po kolei do dozownika chromatografu za pomocą mikrostrzykawki po 1 l roztworu. Po wstrzyknięciu próby do dozownika strzykawkę przemywamy kilkakrotnie metanolem. Przed wstrzyknięciem każdej próby należy odpowiednio zaprogramować aparat. Wyniki analizy zarejestrowane przez komputer zostaną wydrukowane przez prowadzącego.

Zadania

- Porównaj czasy retencji substancji analizowanych indywidualnie z ich czasami retencji uzyskamymi podczas analizy mieszaniny.

- Oblicz, jakie ilości substancji były aplikowane do analizy chromatograficznej (w ng/μl).

- Narysuj na wydruku wzory chemiczne analizowanych substancji (IAA i IBA) i przyporządkuj odpowiednim segmentom cząsteczek obserwowane w widmie masowym jony fragmentaryczne.




  1. Oznaczanie ilościowe etylenu metodą chromatografii gazowej GC-FID.

Hormon roślinny etylen jest gazem. Ma on duże znaczenie przy regulacji dojrzewania owoców. Bez niego nie dochodzi do maceracji tkanek i wytworzenia barwników karotenoidowych. Prekursorem etylenu w komórkach jest metionina, a kluczowym enzymem w biosyntezie syntaza kwasu aminocyklopropanokarboksylowego (syntaza ACC lub najkrócej ACS). Aktywność tego enzymu podlega rozlicznym regulacjom zarówno na poziomie ekspresji genów, jak i na poziomie potranslacyjnym. Jednym z czynników stymulujących ekspresję genu ACS jest auksyna. Zbadajmy wpływ auksyny na produkcję etylenu przez tkanki miękiszowe owocu jabłoni.

Do dwóch buteleczek o pojemności ok. 5 ml z zakrętkami z septum wprowadź po 1 g rozdrobnionego na cienkie paseczki materiału roślinnego. Do jednej z buteleczek oznaczonej „0” dodaj 0,8 ml wody destylowanej, a do drugiej oznaczonej „IAA” dodaj 0,8 ml 10 mM roztworu IAA. Buteleczki zakręć, zanotuj godzinę i natychmiast za pomocą gazoszczelnej strzykawki przez septum pobierz kolejno w odstępie 4 minutowym po 0.1 ml gazowej atmosfery z wnętrza buteleczek i wstrzyknij do dozownika chromatografu gazowego. Dobrze zakręcone buteleczki odstaw na okres 1 godziny, po czym wykonaj ponowne analizy atmosfery w buteleczkach. Nie odkręcając buteleczek pozostawiamy je na dalszą godzinę i po raz kolejny dokonujemy pomiarów. Przed każdym wstrzyknięciem próby strzykawkę „przepłukujemy” kilkakrotnie powietrzem.

W międzyczasie wykonujemy tzw. krzywą wzorcową zależności reakcji detektora (powierzchni piku) od ilości aplikowanego etylenu. W tym celu z butelki zawierającej czysty etylen pobieramy przez septum za pomocą gazoszczelnej strzykawki 0,35 ml gazu i wprowadzamy go do innej zamkniętej septum, zaopatrzonej w mieszadło (probówka Eppendorfa) butelki o pojemności 350 ml (oznaczyć ją jako A). Zawartość wytrząsamy, po czym pobieramy z niej 3,5 ml gazu i przenosimy do butelki kolejnej (oznaczyć ją jako B). Za pomocą gazoszczelnej strzykawki pobieramy z ostatniej butelki 100 μl gazu i wstrzykujemy do chromatografu. Jeśli detektor nie wykryje obecności etylenu to wykonujemy kolejną analizę pobierając 20 μl gazu z butelki A. Jeśli odpowiedź detektora będzie wynosiła ok. 10 mikroamprów, to należy wykonać pomiary wartości sygnału przy 40, 60, 80 i 100 μl próbki. Jeśli wartość dla 20 μl gazu z butelki A będzie się dużo różniła od wartości 10 μamperów, należy zastosować odpowiednie rozcieńczenia lub zatężenia etylenu.

Pomiary etylenu w chromatografie wykonujemy wg. zaprogramowanej wcześniej metody chromatograficznej na kolumnie RTX-5, 30m/0,53 mm/1,5 m. Wyniki analizy rejestrowane są za pomocą komputera.
Zadania

- oblicz stężenie etylenu w butelce A i B

- na podstawie uzyskanej krzywej wzorcowej wyznacz stężenie etylenu w atmosferze w buteleczkach z tkanką roślinną dla poszczególnych czasów inkubacji.

Wyniki 2008/2009

Grupa IV



Widma masowe pikow o czasach retencji 11.06 min z chromatogramu Fitochr9 i 13.25 min z chromatogramu Fitochr 10


Grupa V


Grupa I


Grupa II


Grupa III


Grupa IVa


Grupa Va


Grupa Ia


Grupa IIa


Grupa IIIa


WYNIKI

Poniżej przykładowe wyniki (chromatogramy i widma):


Mix Grupa I ng


Brudna strzykawka

IBA Grupa I ng


IBA Grupa II ng


Mix Grupa II ng


20µl

40µl

60µl

80µl

100µl

32968

91822

151121

203859

251259

roztworu etylenu




©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna