Biologia komórki; 17-21. XII. 2012 Kultury komórkowe jako model eksperymentalny; Wybrane techniki frakcjonowania I hodowli komórek



Pobieranie 35.8 Kb.
Data08.05.2016
Rozmiar35.8 Kb.

BIOLOGIA KOMÓRKI; 17-21.XII. 2012

Kultury komórkowe jako model eksperymentalny; Wybrane techniki frakcjonowania i hodowli komórek

Hodowle komórkowe służą zarówno do badań podstawowych wielu procesów biologicznych jak i do celów aplikacyjnych, tj np. inżynierii tkankowej.


W pierwszym przypadku dostarczają relatywnie prosty model doświadczalny: W przeciwieństwie do tkanek zawierających niekiedy kilkanaście różnych typów komórek, kultury komórkowe pozwalają hodować komórki określonego, wybranego typu i umożliwiają badania takich procesów jak podziały (proliferacja) komórek, formowanie sie organelli subkomórkowych, sekrecja białek i różnicowanie w tkankę o określonym i zdeterminowanym fenotypie. W przypadku inżynierii tkankowej, pozwalają na skomplikowane manipulacje prowadzące do utworzenia nowej, zregenerowanej tkanki, które odbywać sie mogą poza organizmem dawcy/biorcy, w laboratorium.
Komórki zwierzęce są trudniejsze do hodowli niż komórki mikroorganizmów (tj bakterie, drożdże) ponieważ wymagają znacznie większej ilości składników odżywczych, a ponadto większość hodowli komórek zwierzęcych wymaga odpowiednich podłoży umożliwiających przyczepienie się (adhezję) komórek i ich wzrost zależny jest od podłoża.
Dziewięć (9) aminokwasów, które nie mogą być syntetyzowane przez dorosłe zwierzęta kręgowe to histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan i walina. Muszą być one dostarczone w pożywce hodowlanej. Ponadto, komórki w hodowli zwykle wymagają podania cysteiny, glutaminy oraz tyrozyny, ponieważ te aminokwasy są syntetyzowane wyłącznie przez wyspecjalizowane komórki w żywym organiźmie, jak np. komórki wątroby produkują tyrozynę z fenyloalaniny, a komórki wątroby i nerek produkują glutaminę. Inne niezbędne składniki pożywek hodowlanych to witaminy, sole, glukoza i surowica (niekomórkowa część krwi).
Surowica jest mieszaniną białek i czynników, które umożliwiają utrzymanie komórek w hodowli. Zawiera m. in. insulinę, hormon wzrostowy wielu komórek kręgowców, oraz transferynębiałko przenoszące żelazo, niezbędne do wchłaniania żelaza przez komórki. Często dodanie specyficznych czynników wzrostu bądź hormonów nie wchodzących w skład surowicy jest konieczne do utrzymania hodowli, np. erytropoetynę dodaje się do hodowli prekursorów erytrocytów a interleukinę 2 do hodowli limfocytów T. Niemniej jednak wiele komórek zwierzęcych można hodować w bezsurowiczym środowisku używając odpowiednich hormonów i czynników wzrostowych dodanych w wystraczającej ilości do pożywki podstawowej.
Klasyfikacja hodowli komórek/tkanek:
Hodowle pierwszorzędowe i drugorzędowe = pierwotne i wtórne: Hodowle ustanowione z komórek pobranych bezpośrednio z organizmu to tzw. hodowle pierwotne (pierwszorzędowe). Można je wyprowadzić z uzyskanych mechanicznie drobnych fragmentów, tzw. eksplantów, świeżo wyciętych kawałków tkanki bądź narządu lub z zawiesiny powstałej po ich rozproszeniu działaniem enzymów.
Komórki, które porosną 100% powierzchni wzrostowej naczynia hodowlanego to tzw. hodowla konfluentna (z ang. „confluent monolayer). W takiej hodowli dochodzi do zahamowania kontaktowego wzrostu. Komórki przestają się dzielić, hodowla starzeje się i obumiera. Niektóre komórki dobrze proliferujące nie przejawiają jednak zahamowania kontaktowego, rosną dalej, tworząc hodowle dwu- i wielowarstwowe. Np. w hodowlach komórek nowotworowych i hodowlach wielu lini komórkowych zahamowanie kontaktowe nie występuje.
W większości wypadków wyhodowane komórki można odkleić/oderwać od podłoża i namnożyć (subkultura) w większych naczyniach do dalszych eksperymentów. Czynność taką nazywa się pasażowaniem komórek, a hodowlę po pasażu nazywa się hodowlą wtórną lub drugorzędową.
Linie komórkowe: Większość komórek ma określony czas życia w hodowli i starzeje się podobnie jak każdy prosty czy złożony organizm. Proces starzenia w hodowli nazywa się z ang. „senescence”. Np. ludzkie fibroblasty zwykle dzielą się tylko 20-40 razy. Jest to związane ze skracaniem się telomerów przy każdym podziale komórki (telomery: powtarzające się sekwencje DNA z towarzyszącymi im białkami na każdym końcu chromosomu). W normalnych komórkach somatycznych (tj wszystkich komórkach budulcowych organizmu, z wyjątkiem komórek rozrodczych) enzym telomeraza jest nieaktywna i stąd skracanie telomerów przy każdym podziale komórki. Telomeraza jest odwrotną transkryptazą i dobudowuje specyficzną sekwencję DNA (u kręgowców jest to sekwencja "TTAGGG").
Linie komórkowe nowotworowe mogą być łatwo wyprowadzone z komórek nowotworowych.
Jednym ze sposobów „unieśmiertelnienia” danej populacji komórek jest ekspresja telomerazy w komórkach. Czasami jednak taka „manipulacja hodowli” nie jest wystarczająca, ponieważ oprócz regulacji podziałów w oparciu o długość telomerów komórki dysponują też mechanizmami „zahamowania cyklu komórkowego”. Wówczas potrzeba dodatkowych manipulacji hodowli polegających na zahamowaniu lub zlikwidowaniu w.w. mechanizmów poprzez np. wprowadzenie odpowiednich onkogenów wywołujących w normalnych warunkach nowotwory, a wywodzących się z wirusów onkogennych.
W komórkach somatycznych gryzoni, w przeciwieństwie do komórek ludzkich, telomeraza nie jest unieczynniana, telomery nie ulegają sróceniu przy podziałach, a komórki samoczynnie ulegają w hodowli zmianom genetycznym i wyłaczją naturalny proces zahamowania cyklu komórkowego, stąd często mowa o tzw. „spontanicznie unieśmiertelnionych liniach komórek mysich itp.”
Embrionalne komórki macierzyste, a także w pewnym stopniu komórki macierzyste dorosłych osobników charakteryzuje również „nieśmiertelność”, tzn. mogą się one dzielić „bez końca”, a przy tym zachowują zdolność różnicowania w dowolny fenotyp (embrionalne) lub przynajmniej fenotyp kilku tkanek danej grupy (np. różne komórki tkanki łącznej).
Należy pamiętać, że linie komórkowe będą zawsze odbiegać swoją charakterystyką od hodowli pierwotnych czy wtórnych komórek ze względu na procesy prowadzące do ich unieśmiertelnienia. Z kolei pierwotne i wtórne monokultury nie będą do końca oddawać warunków i procesów zachodzących in vivo, gdzie komórki rosną w wymiarze 3D i komunikują się zazwyczaj z wieloma typami komórek, a nie tylko między sobą.
Hodowle w zawiesinie: Większość komórek w hodowli wymaga przyczepienia się (zakotwiczenia) do podłoża, ale niektóre komórki mogą proliferować w zawiesinie. Dysponujemy też technikami umożliwiającymi hodowanie również prawidłowych komórek w zawiesinie w prostych lub skomplikowanych bioreaktorach.
Przykłady komórek zwierzęcych (kręgowców) rosnących w zawiesinie to komórki krwi (tj pnia hemopoetycznego), stransformowane linie komórkowe oraz komórki nowotworowe.
Niektóre komórki wymagają ko-kultury z innymi komórkami. Istnieją też odpowiednie mikronośniki umożliwiające hodowle trójwymiarowe, takie jak żele kolagenowe, gąbki celulozowe, kulki dekstranowe oraz naturalne matryce w postaci skrzepów fibryny oraz oczyszczonego fibrynogenu z trombiną. Ponadto znane są metody zapobiegające adhezji komórek w hodowli. Np. zastosowanie agaru lub agarozy jako podłoża hodowlanego zapobiegnie przyczepianiu się komórek, a zastosowanie metylocelulozy spowolni sedymentację komórek na podłożu. Wreszcie zastosowanie odpowiednich wkładów do naczyń hodowlanych z filtrami o odpowiednich porach umożliwia prowadzenie hodowli spolaryzowanych. Hodowle takie pozwalają odtworzyć in vitro morfologię komórek podobną do warunków fizjologicznych i uzyskać np. bigunowość komórek nabłonkowych z mikrokosmkami na jednym biegunie.
Hodowle przestrzenne: Są to hodowle, w których odtwarza się wzajemne przestrzenne kontakty między komórkami oraz charakterystyczny ukierunkowany układ poszczególnych typów komórek tkanki. Do hodowli takich zalicza się tak proste ko-kultury, hodowle spolaryzowane, agregaty i sferoidy jak i bardziej skomplikowane hodowle organotypowe i narządowe.
Standardowe naczynia hodowlane to obecnie naczynia wyprodukowane z plastiku, najczęściej polistyrenu. Polistyren produkcyjny jest hydrofobowy, dlatego wymaga dodatkowego traktowania celem umożliwienia adhezji komórek oraz ich hodowli w płynnych pożywkach. Zwykle do tego celu polistyren naświetlany jest promieniami gamma lub traktowany chemicznie, aby wprowadzić ładunek powierzchniowy który umożliwia zwilżenie. Istnieje jednak szereg alternatywnych, specjalistycznych metod hodowli komórek jak np. hodowle na podłożach z naturalnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej, np. polistyrenie traktowanym kolagenem, fibronektyną czy lamininą.
Pozostałe, istotne parametry hodowli, to utrzymanie odpowiedniej temperatury (zwyke 37°C), dostęp tlenu (naczynia hodowlane posiadają odpowiednie filtry lub nie są szczelnie zamykane), dostęp CO2 (zwykle 5 – 7.5%), który m.in. pozwala utrzymać odpowiednie pH w pożywkach hodowlanych w szczelnie zamkniętym pomieszczeniu inkubatora hodowlanego; oraz utrzymanie wysokiej wilgotności powietrza.

Izolacja komórek i tkanek oraz rozdział organelli
Pierwszym etapem izolacji z tkanki komórek o określonym typie jest oddzielenie ich od macierzy zewnątrzkomórkowej, która spaja komórki w tkance. W tym celu rozdrobnione mechanicznie tkanki są zwykle traktowane enzymami proteolitycznymi (np. trypsyna, kolagenaza) aby strawić białka macierzy oraz czynnikami takimi jak EDTA, które wiążą jony wapnia od których zależy adhezja komórka-komórka. Jeśli interesują nas frakcje subkomórkowe, błonę komórkową można następnie rozbić poprzez szok osmotyczny, traktując komórki ultradźwiękami, za pomocą niejonowych detergentów lub przez kontrolowane tarcie mechaniczne (np. przecierając komórki przez gęste sita lub ucierając w homogenizatorach/mikserach).
W dalszych etapach wykorzystuje się na ogół: A. Różnice w wielkości i ciężarze komórek danego typu; stosując metody wirowania przy określonych prędkościach można rozdzielić większe i cięższe komórki od mniejszych i lżejszych albo rozdzielić frakcje subkomórkowe jak przedstawiono na jednym z załączonych schematów. B. Wirowania w gradiencie gęstości pozwalają na bardziej precyzyjne rozdzielenie odpowiednich frakcji o podobnych gęstościach i polegają na ostrożnym nawarstwieniu homogenatu na odpwiedni roztwór tworzący gradient gęstości. Gradienty gęstości przygotowuje się z takich substancji jak sacharoza, fikol (syntetyczny polisacharyd), chlorek cezu itp. Przy tym, gradient może być skokowy albo ciągły, a wirowanie strefowe (zależne od współczynnika sedymentacji danej frakcji) lub równowagowe (zależe od gęstości danej frakcji). Przy zastosowaniu niskiego gradientu odmienne komponety tkanek lub odmienne frakcje subkomórkowe sedymentują z różną prędkościa w zależności od ich rozmiaru i kształtu i tworzą frakcję widoczną jako prążek w probówce wirówkowej. Wirowanie w wysokim gradiencie pozwala na rozdział frakcji niezależnie od rozmiaru i kształtu, tak że w odpowiednie frakcje sedymentują do momentu uzyskania gęstości identycznej z gęstościa roztworu w którym są rozdzielane. C. Inną, wyspecjalizowaną metodą separacji komórek jest ich rozdział z wykorzystaniem cytofluorymetru przepływowego (FACS). Wykorzystuje się tj przeciwciała połączone z odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym, które łączą się ze specyficznym typem komórek. Tak wyznakowane komórki można rozdzielić od niewyznakowanych (bądź wyznakowanych inaczej) w cytofluorymetrze przepływowym. Schemat takiego cytofluorymetru można znaleźć poniżej.
Działanie cytofluorymetru przepływowego: Przepływające przez aparat komórki poddane są działaniu wiązki światła laserowego, a komputer monitoruje ich fluorescencję zależną od użytych do znakowania komórek przeciwciał. Urządzenie nadaje następnie każdej komórce ładunek ujemny lub dodatni w zależności od tego czy jest wyznakowana fluorescencyjnie czy nie (albo czy jest wyznakowana taki, a nie inny sposób), a następnie przyłożone pole elektryczne kieruje odmiennie naładowane komórki do osobnych naczyń zbiorczych. Inne (poza sortowaniem komórek) zastosowania cytofluorymetru przepływowego to:Analiza cyklu komórkowego (na ogół pomiar ilości DNA); analiza programowanej śmierci komórek (zmiany morfologii lub zmiany funkcjonalne/biochemiczne, jak np. utrata potencjału błon mitochondrialnych, specyficzne interakcje białek (np. bcl2/BAX itp); analiza fenotypowa i funkcjonalna komórek macierzystych; badania pobierania i uwalniania jonów wapnia pod wpływem różnorakich czynników itp itd
Sposoby analizy danych z FACS (zobacz wykresy).








Frakcje wędrują w zależności od ciężaru (im lżejsza frakcja, tym większej prędkości trzeba użyć aby osiadła na dnie probówki)

Frakcje wędrują w zależności od współczynnika sedymentacji, gdy użyje się niskiego gradientu cukru (ok. 5 – 20%) albo w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (ok. 20 – 70%)






Przykłady analizy danych z FACS:







Wykres przedstawia wyniki z kilku eksperymentów, w każdym zastosowano tylko JEDEN znacznik florescencyjny. Pozwala on uzyskać liczbę komórek wyznakowanych i intensywność fluorescencji emitowanej przez wyznakowane komórki.

Wykres przedstawia wynik pojedynczego eksperymentu w którym użyto DWÓCH znaczników fluorescencyjnych do znakowania tej samej populacji komórek. Liczba komórek wyznakowanych przez dany znacznik (kolor) jest wyrażona poprzez liczbę kropek w danym polu.






©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna