Elektroforeza



Pobieranie 86.95 Kb.
Data09.05.2016
Rozmiar86.95 Kb.
ELEKTROFOREZA

  • ruch fazy rozproszonej względem fazy rozpraszającej zachodzący względem przyłożonej z zewnątrz różnicy potencjałów elektrycznych

  • wędrówka w polu elektrycznym cząsteczek posiadających ładunek (dodatni lub ujemny) i proces ich rozdzielania na skutek różnicy szybkości wędrowania w:

- roztworze (elektroforeza swobodna)

- w nośnikach


Szybkość poruszania się cząstek w polu elektrycznym zależy od:

1. Właściwości rozdzielanych cząstek



    • wielkość i znak ładunku

    • zdolność do dysocjacji

    • zdolność do tworzenia związków kompleksowych ze składnikami środowiska

    • rozmiary cząstki

    • kształt cząstki

2. Parametrów przepływającego prądu

    • wielkość przyłożonego napięcia

    • natężenie pola elektrycznego

 =  ∙ E

 – szybkość poruszania się cząstki [cm ∙ s-1]

- ruchliwość elektroforetyczna cząstki [cm2 ∙V-1 ∙s-1]

E – natężenie pola elektrycznego [V ∙ cm-1]

3. Środowiska



    • rodzaj rozpuszczalnika

    • lepkość roztworu

    • pH roztworu

    • siła jonowa roztworu

    • temperatura


Nośniki w elektroforezie:

  • bibuła

- filtracyjna

- octan celulozy



  • żele

- krzemionkowy

- dekstranowy

- agarowy

- skrobiowy

- agarozowy

- poliakrylamidowy


Ruchliwość elektroforetyczna

  • prędkość cząsteczki w polu elektrycznym o gradiencie potencjału równym jedności

  • droga przebyta przez cząsteczkę [cm] w ciągu 1 sekundy przy spadku potencjału 1 V/cm


Ruchliwość elektroforetyczna

- ładunku cząstki

- promienia cząstki (masy cząsteczkowej)

- lepkości środowiska

- stężenia i ładunku jonów elektrolitu (roztworu buforowego)

- pH elektrolitu

- wielkości potencjału elektrokinetycznego (podwójna warstwa elektryczna na granicy

cząstek i elektrolitu)

- rodzaju nośnika


Elektroforeza w nośnikach

1. Fazy


    • nośnik

    • rozpuszczalnik

    • substancja w rozpuszczalniku

2. Zjawiska towarzyszące elektroforezie

    • elektroosmoza (elektroendoosmoza)

    • adsorpcja

    • dyfuzja

    • hydrodynamiczny przepływ cieczy

    • efekt sitowy


Elektroforeza bibułowa

Zjawiska elektrokinetyczne towarzyszące rozdziałowi mieszaniny:

  • elektroosmoza = ruch roztworu względem fazy stałej pod wpływem przyłożonego napięcia

  • adsorpcja cząstek koloidu na nośniku

  • dyfuzja cząstek koloidu wzdłuż paska bibuły oraz w kierunku prostopadłym

  • parowanie roztworu

- zagęszczenie elektrolitu

- wysychanie bibuły


Elektroforeza bibułowa białek surowicy

1. Przyrządy i bufory



  • komora elektroforetyczna

  • elektrody

  • źródło prądu – prąd stały

- napięcie 3,5 – 5 V na cm długości paska

- natężenie – 0,2 mA na 1 cm długości paska



  • bufory – np. weronalowy (pH 8,6, siła jonowa = 0,05 – 0,1)

2. Przygotowanie elektroferogramu

  • bibuła (Whatman nr 1)

  • ilość surowicy i sposób nakładania na pasek bibuły

- 2-3 krotnie rozcieńczona surowica (przy prawidłowej zawartości albumin)

- błękit bromofenolowy (śledzenie EF)

- 6 – 10 mL rozcieńczonej surowicy – na linię startu (ok. 3 cm od środka paska w

kierunku katody) w postaci wąskiej liniowej plamy

- surowice umieszcza się na pasku wilgotnym


  • wysycenie parą wodną całej komory (ok. 1 godz)

  • rozdział – kilkanaście godzin

3. Suszenie i barwienie pasków

  • temperatura pokojowa lub 37°C

  • barwienie

- błękit bromofenolowy – wiąże się ilościowo ze wszystkimi frakcjami, ulega

ilościowo desorpcji z paska, w zakresie wartości A do 0,5 zachowana jest zależność od

prawa Beera

- azokarmin B – wiąże się w równym stopniu ze wszystkimi frakcjami

- czerń sudanowa, Sudan III, czerwień olejowa do wykrywania lipoprotein surowicy

krwi


4. Analiza ilościowa elektroferogramu

  • metody pośrednie - elucja barwnika i oznaczanie kolorymetryczne poszczególnych frakcji

  • metody bezpośrednie – pomiar fotometryczny natężenia barwy w miejscach odpowiadających poszczególnym frakcjom


Średnie wartości poszczególnych frakcji białkowych surowicy krwi u ludzi zdrowych:

  • albumina - 56 %

  •  – globulina – 5 %

  • – globulina – 8 %

  •  – globulina – 11 %

  •  – globulina – 20 %


Techniki z wykorzystaniem EF bibułowej

    • elektroforeza dwukierunkowa

    • elektrochromatografia


Elektroforeza na żelach

1. Żel skrobiowy

2. Żel agarozowy

3. Żel poliakrylamidowy

- EF w warunkach denaturujących

- EF w warunkach niedenaturujących

- ogniskowanie izoelektryczne
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

1. Duża rozdzielczość

2. Łatwość standaryzacji
Poliakrylamid (Cyanogum 41)


  • ściśle określony skład chemiczny

  • spolimeryzowany jest:

- nierozpuszczalny

- bezbarwny

- przezroczysty
Żel poliakrylamidowy


  • powstaje w wyniku polimeryzacji monomerów : akrylamidu i N,N-metylenobisakrylamidu (czynnika sieciującego) w obecności inicjatora i katalizatora, w temperaturze pokojowej

  • wielkość porów sieci zależy od proporcji pomiędzy monomerami

  • ruchliwość elektroforetyczna w żelu poliakrylamidowym zależy od ładunku i masy cząsteczkowej analizowanych składników mieszaniny

SDS-PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym przebiegająca w warunkach denaturujących

białka + 0,1% SDS + 2-merkaptoetanol




gotowanie 2-5 min


rozwinięcie białek + związanie SDS (1 cząsteczka SDS na 2 reszty aminokwasowe) = nadanie białkom ładunku ujemnego


wędrówka białek do anody (ruchliwość zależy głównie od masy cząsteczkowej)


Ogniskowanie izoelektryczne

  • rozdział w żelu poliakrylamidowym, w którym utworzono gradient pH między katodą i anodą

  • białka wędrują w żelu do miejsc, w których pH odpowiada ich punktowi izoelektrycznemu pI

  • zwykle w obecności dużych stężeń mocznika i niejonowych detergentów (analiza białek prawie nierozpuszczalnych w roztworach fizjologicznych)


Western blotting (immunoblotting)

Etapy:


  • rozdział białek w żelu poliakrylamidowym

  • elektrotransfer rozdzielonych białek na membranę

  • inkubacja z roztworem blokującym wolne miejsca na membranie

  • inkubacja ze swoistymi przeciwciałami pierwotnymi

  • inkubacja z immunoglobulinami skierowanymi przeciwko przeciwciałom pierwotnym (przeciwciałami wtórnymi)

  • identyfikacja kompleksu antygen - przeciwciało


Immunoelektroforeza

Etapy:


  • elektroforeza w żelu agarozowym

  • immunodyfuzja - dyfuzja przeciwciał przeciwko rozdzielonym białkom

W strefach ekwiwalencji powstają łuki precypitacyjne – ich kształt i położenie są charakterystyczne dla danego białka
Elektroforeza kapilarna (HPCE)

  • kapilary o średnicy wewnętrznej od 25 do 75 mm

  • napięcie w granicach od 10 do 30 kV, dające pole elektryczne w kapilarze w granicach od 100 do 500 V∙cm-1

  • detektor

- absorpcjometryczny uV

- fluorymetryczny

- amperometryczny

- spektrometr mas

- konduktometryczny

JAKOŚCIOWE I ILOŚCIOWE METODY OZNACZANIA ANTYGENÓW OPARTE NA TWORZENIU IMMUNOPRECYPITATÓW
Tworzenie się immunoprecypitatów antygen-przeciwciało
Etap 1: tworzenie pojedynczych kompleksów Ag-Ab

Etap 2: kompleksy Ag-Ab agregują



Etap 3: utworzenie sieci makromolekularnej – nierozpuszczalnych kompleksów, które bardzo łatwo precypitują
Reakcje precypitacji wykonuje się w żelu agarozowym. Żel jest strukturą porowatą wypełnioną roztworem elektrolitu o odpowiednim składzie i pH i stanowi środowisko, w którym dochodzi do dyfuzji antygenu i przeciwciała. Przy równoważnej ilości reagentów powstaje nierozpuszczalny osad w postaci wyraźnej linii lub smugi precypitacyjnej, która pojawia się na granicy stref dyfuzyjnych antygenu i przeciwciała.
Kompleks Ag-Ab może powstać jedynie przy określonym stosunku ilościowym obydwu reagentów.


Krzywa precypitacji Heildelberga

W układzie, w którym stała ilość przeciwciała reaguje ze wzrastającą ilością rozpuszczalnego antygenu wyróżniamy 3 strefy:

  1. Strefa nadmiaru przeciwciał

  2. Strefa równowagi (ekwiwalencji) – cała pula przeciwciał obecnych w układzie jest wysycona antygenem i kompleksy ulegają precypitacji

  3. Strefa nadmiaru antygenu (kompleksów rozpuszczalnych)




  1. Podwójna dyfuzja według Ouchterlony’ego

Zarówno antygeny, jak i przeciwciała mają zdolność swobodnej dyfuzji w żelu agarozowym lub agarowym. Po naniesieniu ich do oddzielnych, okrągłych otworków o identycznej średnicy, położonych w standardowej odległości 1 cm, będą się rozchodzić w żelu promieniście we wszystkich kierunkach. W miejscu spotkania antygenu i specyficznego względem niego przeciwciała, gdy ich proporcje są optymalne, tworzą kompleksy antygen-przeciwciało, które następnie ulegają precypitacji i są widoczne w postaci białych, lekko opalizujących linii precypitacyjnych (łuków precypitacyjnych).
Test Ouchterlony’ego pozwala stwierdzić:

  • czy przeciwciało jest swoiste w stosunku do analizowanego antygenu

  • czy w roztworze znajduje się antygen zdolny do rekcji z przeciwciałem znanej specyficzności

  • stopień podobieństwa antygenowego na podstawie położenia powstałych łuków precypitacyjnych

W reakcji podwójnej dyfuzji w żelu agarozowym w zależności od puli zastosowanych antygenów i przeciwciał można wyróżnić trzy typy reakcji:


  1. Reakcja identyczności = gdy występuje układ takich samych antygenów rozpoznawanych przez specyficzne przeciwciało. Powstające łuki precypitacyjne zlewają się końcami i tworzą łuk w kształcie litery V, który jest wyrazem antygenowej zgodności. Oba antygeny zawierają identyczne epitopy. W reakcji identyczności dwa takie same antygeny dyfundują w agarze z tą samą prędkością. Jeżeli stężenia antygenów są różne może się utworzyć niesymetryczny łuk precypitacyjny.




  1. Reakcja braku identyczności (braku zgodności)zachodzi, gdy porównywane antygeny są całkowicie odmienne pod względem struktury antygenowej (posiadają odmienne epitopy) i nie maja wspólnych determinant, natomiast użyta surowica jest poliwalentna i zawiera przeciwciała specyficzne dla każdego z nich. Powstaje obraz linii precypitacyjnych, które krzyżują się, co potwierdza niezależność układów precypitacyjnych.




  1. Reakcja częściowej identyczności (częściowej zgodności) – gdy porównywane antygeny są częściowo pokrewne pod względem struktury (zawierają częśiowo identyczne epitopy). Powstaje precypitat zakończony ostrogą po stronie antygenu zawierającego więcej determinant antygenowych rozpoznawanych przez użyte przeciwciało. Wielkość i położenie ostrogi wskazuje antygen zawierający więcej determinant rozpoznawanych przez przeciwciała.

Ilość linii precypitacyjnych jest zależna od ilości i rodzaju przeciwciał obecnych w surowicy odpornościowej oraz badanej substancji antygenowej. Odczyn precypitacyjny zachodzący w żelu pozwala na jednoczesną analizę wielu układów antygen-przeciwciało. W przypadku antygenów o zbliżonej masie cząsteczkowej linie precypitacyjne nachodzą na siebie i mogą się zlewać.





II. Ilościowa immunodyfuzja radialna (test Mancini)

Pozwala na oznaczenie stężenia antygenu w materiale biologicznym. Metodą radialnej immunodyfuzji oznacza się białka w płynach ustrojowych w tym również immunoglobulin, które w tym przypadku są traktowane jako antygeny. Immunoglobuliny są oznaczane w surowicy, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym.


Metoda opiera się na pomiarze pierścienia precypitacyjnego powstałego w agarozie w wyniku reakcji między antygenem i i specyficznym w stosunku do niego przeciwciałem.

Do żelu dodaje się przeciwciała poliklonalne, specyficzne wobec antygenu, którego stężenie chce się oznaczyć.

Antygeny dodane do otworków wyciętych w żelu z przeciwciałami dyfundują promieniście we wszystkich kierunkach. Szybkość dyfuzji w żelu zależy od jego gęstości i od masy cząsteczkowej antygenu. Odległość na jaką będą dyfundowały antygeny zależy od ich stężenia w badanym materiale i ilości przeciwciał w żelu. Antygeny wędrują do momentu osiągnięcia strefy równowagi i wtedy można obserwować powstawanie kręgów precypitacyjnych, których średnica jest proporcjonalna do stężenia antygenu.

Istnieją różnice w czasie dyfuzji dla poszczególnych antygenów i przeciwciał – wynikają one głównie z różnic masy cząsteczkowej i awidności przeciwciał:

- do oznaczania IgG potrzeba 24-48 godzin

- do oznaczania 2-makroglobuliny 48-80 godzin

Oznaczenia powinno się wykonywać przy dwóch różnych rozcieńczeniach próby – po przeliczeniu uwzględniającym rozcieńczenie wynik powinien być identyczny.

Równolegle z badanymi próbami wykonuje się test z użyciem rozcieńczonego wzorca – w celu sporządzenia krzywej wzorcowej (3-5 punktowej), która jest wykresem zależności średnicy powstałego precypitatu od stężenia antygenu w próbach wzorcowych.

Metodą Mancini najczęściej oznacza się stężenie: albuminy, składowych dopełniacza, kwaśnej 1-glikoproteiny, 1-antychymotrypsyny, apolipoprotein, CRP, haptoglobiny, ceruloplazminy, transferryny, fibronektyny, lizozymu, immunoglobulin IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, podklas immunoglobulin: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, łańcuchów lekkich immunoglobulin kappa i lambda.
III. Elektroimmunodyfuzja (elektroforeza przeciwprądowa)

Przy zastosowanej w teście wartości pH oznaczane antygeny i używane do ich wykrycia specyficzne przeciwciała są obdarzone przeciwnym ładunkiem. Czułość elektroforezy przeciwprądowej jest 10-20 razy większa niż podwójnej immunodyfuzji.

Elektroimmunodyfuzję przeprowadza się w żelu agarozowym w buforze, którego pH musi znajdować się pomiędzy pIAg a pIAb – najczęściej stosowany jest bufor weronalowy o pH wynoszącym 7,5-8,0. Przy takim pH większość antygenów (np. białka surowicy) ma ładunek ujemny, natomiast większość przeciwciał ma ładunek dodatni. Antygeny umieszcza się w dołku po stronie elektrody ujemnej natomiast przeciwciała od strony elektrody dodatniej. Po podłączeniu napięcia antygeny i przeciwciała będą wędrować w kierunku przeciwnych elektrod i zbliżać się do siebie – w miejscu spotkania powstają kompleksy Ag-Ab, które precypitują w krótkim czasie po zakończeniu elektroforezy.

Elektroimmunodyfuzja radialna może być wykorzystana do badania, czy w danym materiale znajduje się poszukiwany antygen – na przykład przeciwciała przeciwjądrowe (w chorobach autoimmunologicznych).


METODY IMMUNOCHEMICZNE FAZY PŁYNNEJ

Metoda immunoturbidymetryczna i immunonefelometryczna

Roztwory antygenów i przeciwciał, będąc koloidami, powodują rozpraszanie wiązki światła. Jeśli w tej samej kuwecie umieścimy równocześnie antygen i komplementarne względem niego przeciwciało, powstające w roztworze kompleksy antygen – przeciwciało będą wykazywały zwiększone rozpraszanie wiązki światła, w porównaniu do wyjściowych roztworów zawierających tylko sam antygen lub przeciwciało.

Natężenie światła rozproszonego zależy wprost proporcjonalnie od stężenia cząstek substancji rozpraszającej oraz od wielkości tych cząstek. Zatem pomiary natężenia światła rozproszonego można wykorzystać do oznaczania stężenia antygenu w badanym roztworze.

Zależność ta jest prawdziwa dla roztworów bardzo rozcieńczonych, ponieważ gdy stężenie cząsteczek w roztworze jest zbyt duże, cząstki znajdujące się najbliżej źródła światła będą powodowały całkowite rozproszenie wiązki światła, które nie dotrze do cząstek leżących głębiej. Zbyt duże stężenie cząstek koloidalnych w roztworze będzie powodowało powstawanie zbyt dużej liczby kompleksów, co z kolei doprowadzi do zafałszowania odczytu (do zaniżenia stężenia).

Na wartość natężenia promieniowania rozproszonego mają wpływ warunki otrzymywania koloidów oraz warunki, w których dochodzi do tworzenia kompleksów, m.in.: temperatura, siła jonowa, pH roztworu, sposób i kolejność dodawania odczynników, czas jaki upłynął od ich wprowadzenia, stężenie substancji tworzącej koloid.

Podczas oznaczeń techniką nefelometryczną lub turbidymetryczną oznaczając stężenie antygenu należy równocześnie wykonać krzywą kalibracyjną. Konieczne jest również stosowanie się do wykresu precypitacji Heidelbergera, charakterystycznego dla danego układu Ag-Ab – odczytu wyniku precypitacji dokonuje się tylko w liniowym zakresie precypitacji, przy nadmiarze przeciwciał. Pomiar stężenia w zakresie strefy ekwiwalencji i przy nadmiarze antygenu, gdzie zależność pomiędzy stężeniem antygenu a ilością powstałych kompleksów Ag-Ab nie ma charakteru liniowego, jest niemożliwy. W przypadku dużego stężenia antygenu w próbie utworzone kompleksy Ag-Ab ulegają częściowemu rozbiciu, w wyniku czego obserwuje się fałszywie małe wartości stężenia antygenu (tzw, efekt prostrefowy).

Metodami nefelometryczną i turbidymetryczną można oznaczać stężenie antygenów rozpuszczalnych w materiale biologicznym (w surowicy, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym, płynie owodniowym)

Rutynowo oznacza się stężenie:

Albuminy, składowych dopełniacza C3 i C4, haptoglobiny, ceruloplazminy, transferryny, immunoglobulin IgG, IgM, IgA, łańcuchów lekkich immunoglobulin, -mikroglobuliny, apolipoprotein.


W metodach o zwiększonej czułości (dzięki użyciu kuleczek karboksylowanego lateksu, do których mogą być umocowane są antygeny lub przeciwciała) oznacza się między innymi stężenia takich antygenów jak białko C-reaktywne, ferrytyna, czynnik reumatoidalny (RF) klasy IgG i IgM, antystreptolizyny O (ASO).

Czułość technik z karboksylowanymi cząsteczkami lateksu jest porównywalna z czułością metod z użyciem znaczników (enzymów, pierwiastków promieniotwórczych).


METODY IMMUNOELEKTROFORETYCZNE

Większość odmian immunoelektroforezy przebiega w 2 etapach:



  1. Elektroforezy żelowej – roztwór antygenu lub mieszaniny antygenów nanosi się do studzienek w żelu agarozowym i umieszcza się w polu elektrycznym (rozdział w zależności od ich ruchliwości elektroforetycznej)

  2. Immunoprecypitacji – obecnoć antygenów jest wykrywana za pomocą specyficznych przeciwciał – tworzą się nierozpuszczalne immunoprecypitaty. Etap ten może być realizowany podczas:

  • swobodnej immunodyfuzji obydwu reagentów (immunoelektroforeza prosta)

  • w miejscu położenia antygenu w żelu w wyniku immunoprecypitacji przez przeciwciało in situ (immunofiksacja)

  • wymuszonej wędrówki antygenu w polu elektrycznym przez żel zawierający przeciwciała (immunoelektroforeza rakietowa, immunoelektroforeza dwuwymiarowa)



I. Immunoelektroforeza prosta (IEP)

Elektroforeza antygenów w żelu agarozowym, a następnie swobodna immunodyfuzja antygenów rozdzielonych podczas EF i przeciwciał dodawanych w etapie drugim (do rowka w żelu biegnącego równolegle do kierunku rozdziału elektroforetycznego). Antygeny tworzą precypitaty ze specyficznymi, komplementarnymi przeciwciałami (skierowanymi wybiórczo przeciwko poszczególnym białkom). W miejscu spotkania antygenu i przeciwciała tworzą się łuki precypitacyjne. Każda linia precypitacyjna powstaje niezależnie, w wyniku indywidualnej reakcji komplementarnej pary antygen-przeciwciało.

Ocena uzyskanego preparatu opiera się na porównaniu położenia i kształtu łuków precypitacyjnych utworzonych przez analizowane białka z odpowiadającymi im łukami w płynie wzorcowym (np. surowicy zdrowego człowieka) powstałymi podczas tego samego badania i w tych samych warunkach.
Przy ocenie bierze się pod uwagę zmiany jakościowe i ilościowe, które mogą być wyrażone przez:

- obecność lub brak linii precypitacyjnej

- szerokość, kształt, położenie łuku, ostrość linii

- intensywnośc barwy precypitatu

- zmiany w ruchliwości elektroforetycznej linii precypitacyjnej

- pojawianie się łuków dodatkowych

Zastosowanie immunoelektroforezy prostej:

- wykrywanie zaburzeń w biosyntezie białek

- wykrywanie dysproteinemii

- potwierdzenie paraproteinemii

- identyfikacja białka monoklonalnego
II. Immunofiksacja (IFE)

Metoda, w której po elektroforezie antygenów w żelu agarozowym następuje ich immunoprecypitacja in situ. Metoda ta służy do:

- identyfikacji i charakterystyki białek płynów ustrojowych (wykrywanie dysprotein)

- identyfikacja i charakterystyka patologicznych immunoglobulin w surowicy, moczu,

płynie mózgowo-rdzeniowym np. białka monoklonalnego w szpiczaku mnogim

Wykonanie:

- nałożenie analizowanej próbki (surowicy, moczu) w odpowiednich rozcieńczeniach i

identycznej ilości w kilku (najczęściej 6) miejscach startowych

- podczas elektroforezy następuje rozdział białek na frakcje – uzyskuje się identyczny

rozdział na wszystkich ścieżkach

- jedna z dróg rozdziału stanowi rozdział referencyjny dla danego pacjenta (utrwala się go i barwi)

- powierzchnie pozostałych ścieżek pokrywa się roztworami swoistych przeciwciał

- przeciwciała dyfundują w głąb żelu i tworzą immunoprecypitaty z odpowiadającymi im antygenami (pod warunkiem, że antygen jest obecny i reakcja zachodzi w proporcjach ekwimolarnych

- po wypłukaniu nadmiaru reagentów (przeciwciał, białek) żel się suszy i barwi (barwienie ujawnia tylko te białka, które uległy immunofiksacji na skutek immobilizacji w żelu przez swoiste przeciwciało dowodząc, lub nie obecności antygenu


III. Immunoelektroforeza rakietowa według Laurella

Połączenie dwóch technik: radialnej immunodyfuzji i elektroforezy. Jest to metoda ilościowa pozwalająca na bezpośrednie oznaczenie stężenia antygenu białkowego w badanym materiale biologicznym. Antygen przemieszcza się w żelu zawierającym unieruchomione przeciwciała – stężenie antygenu określa się na podstawie wysokości szczytów precypitacyjnych powstałych wtedy, gdy antygen zostanie w całości związany przez przeciwciała.

Do dołków wyciętych z jednej strony płytki nanosi się roztwory antygenów badanych, wzorcowych i kontrolnej (pH układu wynosi 8,0-8,6). Po umieszczeniu płytki w polu elektrycznym antygeny wędrują do anody wiążąc się po drodze z przeciwciałami znajdującymi się w żelu. Po zakończeniu elektroforezy obserwuje się powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało (w strefie równowagi) w postaci rakiet. Wysokość i pole powierzchni pod powstałą rakietą są wprost proporcjonalne do stężenia antygenu w próbie.

Immunoelektroforeza rakietowa nie jest stosowana do oznaczania immunoglobulin ponieważ nie wędrują lub wędrują bardzo słabo w warunkach oznaczenia = ich punkty izoelektryczne są zbliżone lub równe pH użytego buforu.



IV. Immunoelektroforeza dwuwymiarowa (immunoelektroforeza krzyżowa)

Modyfikacja metody rakietowej. Składa się z dwóch etapów: elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie elektroforezy rozdzielonych składników w pierwszym etapie w żelu II wymiaru, zawierającym specyficzne przeciwciała.

Wykonanie:

- rozdział elektroforetyczny mieszaniny antygenów w żelu agarozowym (elektroforeza

I wymiaru)

- po jej zakończeniu żel tnie się na paski odpowiadajże ścieżkom z rozdzielonymi

białkami

- paski żelu przenosi się i układa pod kątem 90° na brzegu drugiej płytki

- na niewypełnioną paskami powierzchnię płytki wylewamy żel agarozę zawierającą specyficzne przeciwciała

- białka próby badanej ponownie poddaje się elektroforezie (w warunkach EF przeciwciała nie poruszają się w polu elektrycznym) – jest to elektroforeza II wymiaru (jej kierunek jest prostopadły do kierunku EF I wymiaru)

- antygeny wędrują w żelu i wiążą się z przeciwciałami – tworzą się linie immunoprecypitacyjne (każde biało tworzy precypitat oddzielnie)

- płytkę płucze się, suszy i barwi

Zastosowanie:

- wykrywanie dysproteinemii



- charakterystyka antygenów
IMMUNOENZYMATYCZNE TESTY FAZY STAŁEJ (ELISA)
Testy ELISA pozwalają na wykrywanie antygenu i określenie jego stężenia w warunkach, gdy stężenie antygenu w materiale biologicznym jest zbyt małe, aby możliwe było powstanie precypitatu w reakcji z przeciwciałem. Mogą być także stosowane do oznaczania jednowartościowych haptenów, które nie maja w ogóle zdolności tworzenia precypitatów z przeciwciałami. Zwiększenie czułości oznaczeń związane jest z unieruchomieniem (immobilizacją) antygenu na stałym podłożu („faza stała”) i zastosowaniem do detekcji znakowanych przeciwciał. Znakowanie = połączenie przeciwciała z substancją, której ilość lub aktywność można zmierzyć. Pierwsze techniki fazy stałej wykorzystywały przeciwciała znakowane pierwiastkiem promieniotwórczym, głównie izotopem jodu 125J i trytem 3H. Potem wprowadzono znaczniki enzymatyczne – początkowo o mniejszej czułości od testów radioimmunologicznych. Obecnie stosowane systemy amplifikacyjne oraz stosowanie chemiluminescencyjnych i fluorescencyjnych substratów zapewniają bardzo wysoką czułość tych reakcji. Obecnie do znakowania ligandów detekcyjnych używa się przede wszystkim enzymów: fosfatazy alkalicznej i peroksydazy chrzanowej, a także fluorochromów, biotyny i koloidów złota.
Substraty reakcji enzymatycznej stosowane w testach immunochemicznych:


Enzym

Metoda

Związek

Odczyt () / barwa

Fosfataza alkaliczna

ELISA

p-nitrofenylofosforan sodowy (pNPP)

410 nm

Bloting

5-bromo-4-chloro-indolilofosforan + błękit nitrotetrazoliowy (BCIP/NBT)

Barwa fioletowa

Peroksydaza chrzanowa

ELISA

o-fenylodiamina (OFD) + H2O2

495 nm

Tetrametylobenzydyna (TMB) + H2O2

650 nm bez przerywania reakcji lub 450 nm po przerwaniu reakcji H2SO4

Bloting

Diaminobenzydyna (DAB) + H2O2

Barwa brązowa

-chloronaftol + H2O2

Barwa fioletowa


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna