Ewelina Zabost Wydział Chemii



Pobieranie 15.68 Kb.
Data07.05.2016
Rozmiar15.68 Kb.

Ewelina Zabost

Wydział Chemii

Uniwersytet Warszawski

Pracownia Teorii i Zastosowań Elektrod



Warszawa, 16 listopada 2010

Autoreferat rozprawy doktorskiej pt.:


Zmiany właściwości podwójnej nici DNA na skutek oddziaływań chemicznych oraz działania czynników fizykochemicznych”
Promotor pracy: Prof. dr hab. Zbigniew Stojek
Dwuniciowa helisa kwasu dezoksyrybonukleinowego (dsDNA) jest swoistym magazynem informacji genetycznej każdej żywej komórki organizmów żywych. Charakterystyczna budowa, właściwości oraz zdolność do dynamicznych zmian struktury helikalnej dsDNA m. in. lokalnego rozluźniania i rozplatania drugorzędowej struktury oraz zmian konformacji, gwarantuje wysoką specyficzność biologicznych procesów zachodzących z udziałem dsDNA takich jak: replikacja oraz transkrypcja. Kwas dezoksyrybonukleinowy może oddziaływać w warunkach in situ oraz ex situ, z różnymi, często mniejszymi cząsteczkami m.in. białkami, jonami czy innymi związkami chemicznymi np. lekami przeciwnowotworowymi. Konsekwencją takich oddziaływań są mniej bądź bardziej znaczące zmiany w budowie oraz strukturze dsDNA.

Do monitorowania zmian struktury helikalnej dsDNA stosuje się wiele metod badawczych. Metody elektrochemiczne także znalazły zastosowanie w tego typu badaniach. Jednakże mierzone sygnały pochodzące od elektroutleniania zasad (guaniny oraz adeniny)


i pojawiające się przy mocno dodatnich potencjałach, były z reguły bardzo słabo wykształcone, co tłumaczono dużym nadpotencjałem tych procesów elektrodowych
i nakładaniem się sygnałów utleniania zasad z prądami tła. Poszukiwano różnych rozwiązań by poprawić jakość ukształtowania tych sygnałów. Jak do tej pory, elektrochemiczna detekcja podwójnej nici dsDNA rozpuszczonej w roztworze, wykonana została jedynie poprzez pomiar pośredni: rejestrowano odpowiedź prądową pochodzącą od mediatora-interkalatora.

Głównym założeniem mojej pracy doktorskiej było znalezienie oraz zaproponowanie takich warunków eksperymentalnych, by można było bezpośrednio rejestrować odtwarzalną anodową odpowiedź elektrochemiczną zasad azotowych w dsDNA rozpuszczonym


w roztworze, bez konieczności wstępnego zatężania tego kwasu na powierzchni elektrody oraz stosowania mediatorów. Opracowanie takich warunków umożliwiło mi użycie sygnału elektroutleniania zasad do opisu zmian konformacji dsDNA, stabilności termicznej dsDNA oraz badania oddziaływań dsDNA z cząsteczkami chemicznymi.

W swoich badaniach zastosowałam różne formy dsDNA: nici natywne (z grasicy cielęcej, ogonów myszy, drożdży), jak również nici syntetyczne o różnych długościach oraz zawierające odpowiednio: 25, 50, 75 oraz 100 % par zasad GC. Ważnym kryterium doboru warunków eksperymentalnych było zachowanie warunków jak najbardziej zbliżonych do warunków fizjologicznych panujących w komórkach żywych (pH roztworu, moc jonowa).

Do kompleksowej oceny zjawiska obok metod elektrochemicznych zastosowałam również metody spektroskopowe (spektroskopię UV-Vis oraz CD). Prowadziłam również badania spektroelektrochemiczne.

W pierwszym etapie mojej pracy przedstawiłam warunki eksperymentalne, jakie muszą być spełnione by móc bezpośrednio rejestrować odtwarzalne sygnały elektroutleniania zasad azotowych guaniny oraz adeniny w dsDNA rozpuszczonego w roztworze.


Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów stwierdziłam, że pierwszym bardzo istotnym warunkiem uzyskania dobrze ukształtowanych oraz odtwarzalnych sygnałów elektroutleniania zasad w dsDNA jest sterylność oraz czystość chemiczna nie tylko elektrod pracujących, ale całego układu pomiarowego. Zaproponowałam więc procedurę czyszczącą, w której jednym z etapów było poddanie wszystkich elementów układu eksperymentalnego działaniu pary wodnej o temp. 120 °C. Kolejnym warunkiem umożliwiającym rejestrowanie odtwarzalnej anodowej odpowiedzi prądowej dsDNA, była czystość badanych preparatów dsDNA. Także odpowiedni dobór materiału elektrodowego był istotny. Przeprowadzone przeze mnie badania pokazały, że spośród platyny i GCE lepszym materiałem do utleniania dsDNA rozpuszczonego w roztworze jest węgiel szklisty, dla którego uzyskano dwa dobrze ukształtowane sygnały elektroutleniania odnoszące się do guaniny oraz adeniny w dsDNA. Nie stwierdziłam też istotnej adsorpcji dsDNA w krótkich czasach. W dalszym etapie badań przeprowadziłam optymalizację procedury elektrochemicznej dla oznaczania dsDNA rozpuszczonego w roztworze. Wraz ze wzrostem szybkości polaryzacji w technice woltamperometrii cyklicznej rosła wartość potencjału (Ep) przy jakim pojawia się dany sygnał utleniania, co jest typowym objawem dla nieodwracalnych procesów elektrodowych. Zastosowanie prze ze mnie technik elektrochemicznych różnicujących prąd (DPV, SWV) znacznie poprawiło jakość uzyskiwanych sygnałów.

W kolejnym etapie swojej pracy zbadałam wpływ temperatury na zmiany właściwości dsDNA rozpuszczonego w roztworze. Do badań zastosowałam opracowaną przeze mnie elektrochemiczną procedurę pozwalającą monitorować sygnały utleniania zasad w dsDNA rozpuszczonym w roztworze. We wszystkich badanych przeze mnie niciach zanotowałam mocny, dwukrotny wzrost prądów elektroutleniania guaniny oraz adeniny w dsDNA w obszarze temperatur poprzedzających denaturację helisy dsDNA. W tym obszarze temperatur zmiany absorbancji w widmie UV-Vis były słabo widoczne. Również nie zarejestrowałam efektów wzmocnienia prądowego dla dsDNA zatężonego na powierzchni elektrody. Wyniki elektrochemiczne i spektroskopowe UV-Vis uzupełniłam badaniami CD. Wykazałam,


że duży wzrost prądu w obszarze temperatur poprzedzającym proces denaturacji odzwierciedla pewne zmiany konformacji dsDNA w wyniku których guanina i adenina są na tyle bardziej wyeksponowane, że wystarcza to do łatwiejszego i pełniejszego czteroelektronowego utlenienia. Dalszy wzrost temperatury nie prowadził już do dodatkowego wzrostu prądu zasad w DNA. Wykazany w moich badaniach wzrost prądu utleniania guaniny w temperaturze ok. 40 °C może znaczyć, że guanina związana w dsDNA
w tej temperaturze może również łatwiej utleniać się chemicznie, co może mieć duże konsekwencje biologiczne i medyczne.

W dalszym etapie swojej pracy przedstawiłam wyniki badań właściwości dsDNA rozpuszczonego w roztworze na skutek oddziaływań różnych typów związków chemicznych. Do tych badań wybrałam naturalną nić dsDNA pochodzącą z grasicy cielęcej. Zastosowałam związki chemiczne, które oddziałują w różny sposób z helisą dsDNA: cis-platynę wiążącą się kowalencyjnie do zasad w nici dsDNA, Hoechst 33258 przyłączający się do zasad dsDNA


w małym rowku oraz interkalatory: bromek etydyny, C-1311 i C-1305 wciskające się pomiędzy płaszczyzny par zasad ułożonych równolegle względem siebie w nici dsDNA. przeprowadzone przeze mnie spektroskopowe badania temperaturowe wykazały, że wszystkie związki (za wyjątkiem cis-Pt) powodują znaczne podniesienie temperatury denaturacji nici dsDNA, a zatem poprawiają stabilność podwójnej helisy. Temperatury topnienia wynosiły odpowiednio: 60 °C dla dsDNA, 62 °C dla dsDNA/cis - Pt, 76 °C dla dsDNA/EtBr, 80 °C dsDNA/C-1311, 83 °C dla dsDNA/Hoechst33258 oraz 85 °C dla dsDNA/C-1305. Zanotowałam również przesuwanie się w kierunku wyższych temperatur krzywych prądowych I – T elektroutleniania guaniny w dsDNA w obszarze predenaturacji dsDNA.
W zależności od typu oddziaływań związków chemicznych z dsDNA zaobserwowałam,
że już w temperaturze pokojowej oddziaływania te wywołują zmiany konformacji B natywnej nici dsDNA, co można zaobserwować na widmach CD dsDNA, jako zmiany eliptyczności
w obszarach odnoszących się do rozrywania wiązań wodorowych (minimum, ujemny efekt Cottona) oraz zmian oddziaływań typu stertowego (maksimum, dodatni efekt Cottona).

W swoich badaniach opisałam również ilościowo, używając modelu McGhee i von Hippel’a, oddziaływania związków C-1305 i C-1311 z nicią dsDNA rozpuszczoną


w roztworze. Są to związki, które mają właściwości przeciwnowotworowe i obecnie znajdują się w fazie badań przedklinicznych oraz klinicznych. Badania prowadziłam w środowisku jak najbardziej zbliżonym do warunków panujących w komórkach żywych. Badaniach elektrochemiczne pozwolił mi na niezależne określanie zmian stężeń wolnych związków oraz niezwiązanej guaniny w dsDNA dzięki temu, że sygnały elektroutleniania położone były przy różnych wartościach potencjałów. Analitycznie użyteczne sygnały wykorzystałam
do utworzenia wykresów Scatcharda, które pokazały, że istnieją dwa rodzaje oddziaływań. Wyznaczyłam obie stałe równowagi: K1 i K2. Określiłam również parametry n oraz m, czyli odpowiednio liczby par zasad oraz grup fosforanowych potrzebnych odpowiednio
do przyłączenia jednej cząsteczki ligandu do nici dsDNA. Dla obu związków C-1311 oraz
C-1305, wskutek przyłączania się ich do helisy dsDNA, zanotowałam spadek wartości prądów elektroutleniania guaniny w dsDNA, który stabilizował się na końcowym poziomie 60 %. Oznaczało to, że oba związki przyłączają się do 60 % centrów - par zasad występujących w nici dsDNA, a przy wyższych stężeniach oddziałują elektrostatycznie nieleektroaktywnymi ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi dsDNA.

Wyniki przedstawione w pracy doktorskiej i uzyskane w trakcie studiów doktoranckich opublikowane zostały w sześciu pracach w czasopismach o charakterze międzynarodowym (Bioelectrochemistry 1x, Electroanalysis 2x, Analytical and Bioanalytical Chemistry 1x, Physical Chemistry Chemical Physic 2x). Kolejna publikacja opisująca wyniki będące częścią niniejszej pracy badawczej znajduje się w końcowej fazie przygotowań.






©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna