Hodowla mikroorganizmów rekombinantowych produkcja białek w komórkach drożdży Pichia pastoris



Pobieranie 6.76 Kb.
Data07.05.2016
Rozmiar6.76 Kb.
Hodowla mikroorganizmów rekombinantowych - produkcja

białek w komórkach drożdży Pichia pastoris

Drożdże łączą zalety prokariotycznych i eukariotycznych systemów ekspresyjnych. Charakteryzuje je szybki wzrost, osiągają też znacznie większą biomasę w porównaniu do bakterii. W odróżnieniu od bakterii, drożdże są zdolne do przeprowadzania modyfikacji posttranslacyjnych białek (glikozylacji, tworzenia mostków disiarczkowych), często niezbędnych dla prawidłowej funkcji białek pochodzących z organizmów wyższych. Kolejną zaletą drożdżowych systemów ekspresyjnych jest zdolność komórek drożdżowych do sekrecji białek do pożywki hodowlanej. Dzięki zastosowaniu szczepu drożdżowego produkującego białko zewnątrzkomórkowo, możliwe jest wyeliminowanie kilku etapów otrzymywania białek rekombinantowych, które są niezbędne w przypadku produkcji białek w bakteriach, np. lizy komórek, czy wieloetapowych procesów oczyszczania. W przemyśle i laboratoriach naukowych najczęściej stosowany jest system drożdżowy Saccharomyces cerevisiae. Obok niego coraz częściej stosowany jest system Pichia pastoris, który posiadając wszystkie zalety systemu opartego na Saccharomyces, zapewnia od 10 do 100 razy wyższy poziom ekspresji klonowanych genów. Wektory plazmidowe w komórkach P. pastoris są stabilne, a sekrecja białek do środowiska zachodzi z wysoką wydajnością.



P. pastoris należy do drożdży metylotroficznych, które wykorzystują metanol jako jedyne źródło węgla. Pierwszy etap w metabolizmie metanolu polega na jego utlenieniu przez oksydazę alkoholową do formaldehydu w obecności tlenu cząsteczkowego. Reakcja zachodzi w peroksysomach, dzięki czemu komórka chroniona jest przed toksycznymi półproduktami reakcji (nadtlenek wodoru). Oksydaza alkoholowa wykazuje słabe powinowactwo do tlenu cząsteczkowego, ale Pichia rekompensuje to poprzez wytwarzanie dużej ilości tego enzymu. Pod kontrolę promotora regulującego produkcję oksydazy alkoholowej wprowadzane są geny mające ulegać ekspresji w tym systemie. Na genomie P. pastoris znajdują się dwa geny kodujące oksydazę alkoholową – AOX1 i AOX2. Ekspresja genu AOX1 jest ściśle regulowana i indukowana przez metanol. Promotor AOX2 jest dużo słabszy i ekspresja z jego udziałem jest mniej wydajna. Wektor ekspresyjny pPICZα, skonstruowany do indukowanej ekspresji genów w P. pastoris zawiera promotor AOX1. Ekspresję genu klonowanego pod kontrolę tego promotora można zatem ściśle kontrolować poprzez zmianę źródła węgla w pożywce hodowlanej. W pierwszym etapie hodowli, którego celem jest uzyskanie dużej biomasy drożdży, jako źródło węgla stosowany jest glicerol. W drugim etapie, którego celem jest produkcja rekombinantowego białka, ekspresję klonowanego genu indukuje się poprzez dodanie do pożywki metanolu. W systemach ekspresji P. pastoris wykorzystywany jest również wektor plazmidowy pGAPZα zawierający promotor GAP dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Geny klonowane pod kontrolę tego promotora ulegają konstytutywnej ekspresji w komórkach drożdży, zatem biosynteza kodowanych przez nie białek nie może być ściśle kontrolowana przez eksperymentatora. Wektory drożdżowe są najczęściej wektorami wahadłowymi, zdolnymi do replikacji zarówno w komórkach drożdżowych, jak i bakteryjnych. Pozwala to na klonowanie genów w E. coli i badanie ich ekspresji w drożdżach. Wektory pPICZα i pGAPZα zawierają ori replikacji pMB1, umożliwiający replikację plazmidów w komórkach E. coli, miejsce wielokrotnego klonowania (MCS, ang. multiple cloning site) oraz gen oporności na antybiotyk zeocynę (marker selekcyjny), ulegający ekspresji zarówno w komórkach P. pastoris, jak i E. coli. Wektory plazmidowe zawierają też sekwencję nukleotydową kodującą peptyd sygnalny, α-faktor z S. cerevisiae, umożliwiający komórkom P. pastoris wydzielanie białek do pożywki hodowlanej. Trwałe transformanty P. pastoris generowane są przez homologiczną rekombinację między transformowanym liniowym DNA plazmidu, a regionami homologicznymi w obrębie genomu.


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna