I technikach pokrewnych u progu XXI. Quo Vadis Chromatographia?



Pobieranie 160.12 Kb.
Strona1/4
Data30.04.2016
Rozmiar160.12 Kb.
  1   2   3   4


ROZDZIAŁ 2

NOWE ROZWIĄZANIA I WYZWANIA W CHROMATOGRAFII
I TECHNIKACH POKREWNYCH U PROGU XXI.*


Quo Vadis Chromatographia?
Bogusław Buszewski i Katarzyna Krupczyńska

Zakład Chemii Środowiska i Ekoanalityki, Wydział Chemii,

Uniwersytet Mikołaja Kopernika, ul. Gagarin 7, 87 100 Toruń


STRESZCZENIE

Postęp, jaki obserwuje się we współczesnej chemii analitycznej, jest konsekwencją rozwoju cywilizacji. Coraz większe oczekiwania w stosunku do obniżenia poziomu oznaczalności wielu analitów w próbkach o złożonym składzie matrycy zmuszają analityków do poszukiwania nowych rozwiązań metodycznych i aparaturowych. Łączenie technik w układy wielowymiarowe i hybrydowe to niewątpliwie przyszłość chemii analitycznej. Możliwe jest to poprzez osiągnięcia w chromatografii i technikach pokrewnych, azwłaszcza rozwój w technologii wypełnień i kolumn, miniaturyzacji, automatyzacji oraz zastosowaniu nowych, selektywnych układów detekcyjnych. Odrębnym zagadnieniem jest postęp w przygotowaniu próbek i włączeniu tego ważnego kroku analitycznego do końcowego schematu oznaczeń jakościowych i ilościowych. To wszystko pozwala na określenie zmian zachodzących w organizmach żywych na poziomie komórki, cząsteczki, genu a więc nowych kierunków badań: proteomiki, genomiki i metabolityki. Tym zagadnieniom poświęcony jest niniejszy rozdział, który w 100-lecie odkrycia chromatografii w Warszawie przez Michała S. Cwieta jest dedykowany zmarłym Profesorom, twórcom Lubelskiej Szkoły Chromatografii, Andrzejowi Waksmundzkiemu i Zdzisławowi Suprynowiczowi.



1. WPROWADZENIE
Burzliwy rozwój cywilizacji i związane z tym sukcesywne wprowadzanie “do obiegu” coraz to nowych związków chemicznych zmusza badaczy do poszukiwania bardziej selektywnych i skutecznych metod ich oznaczania. U podstaw popularności fizykochemicznych technik rozdzielania leży właśnie możliwość jakościowego i ilościowego oznaczania indywiduów chemicznych o zróżnicowanej budowie i właściwościach (kwasy, zasady czy związki neutralne). Ważnym czynnikiem poprawiającym skuteczność analizy jest możliwość selektywnego izolowania i wzbogacania analitów, dzięki czemu realne staje się oznaczanie składników na poziomie ppb, ppt a nawet ppq. Jednakże sytuacja zdecydowanie komplikuje się, gdy oznaczana substancja występuje w próbkach o złożonym składzie matrycy takich, jak: materiał roślinny, tkanka zwierzęca, osady czy gleba. Wówczas konieczne jest stosowanie łączonych technik analitycznych (ang. hyphenated technique) lub układów sprzężonych (ang. coupled technique), które pozwalają nie tylko na oznaczanie ksenobiotyków na niższych poziomach stężeń, ale dają możliwość wykonania analizy specjacyjnej z potwierdzeniem tożsamości analitu. Układy te, jako wysokorozdzielcze często zautomatyzowane (hybrydowe), wymagają stosowania specyficznych wypełnień i kolumn o wyjątkowych właściwościach, charakteryzujących się takimi parametrami, jak: duża liczba półek teoretycznych, rozdzielczość czy szeroki zakres selektywności przy jednoczesnej wysokiej odtwarzalności danych retencyjnych (czas retencji, pole powierzchni piku i kształt piku) [1,2].

W przypadku chromatografii gazowej (GC) problem ten w zasadzie został rozwiązany poprzez wprowadzenie kolumn kapilarnych lub/czy wielokanałowych (multikapilarnych) [2,3]. Jednakże w przypadku innych fizykochemicznych technik rozdzielania, takich jak: chromatografia cieczowa (LC) czy metody elektromigracyjne sprawa nadal jest otwarta i trwają intensywne poszukiwania rozwiązań zarówno teoretycznych jak i technologicznych. Dlatego też wiele oczekuje się po opracowaniach nowej generacji wypełnień przeznaczonych do śledzenia procesów przebiegających na granicy faz czy/i barier biologicznych (np. krew – mózg, komórka – błona biologiczna), a także wykorzystania ich w zminiaturyzowanych układach, pozwalających na uniwersalne stosowanie w przypadku takich technik jak mikro-HPLC, CEC, CZE czy SFE [4-6].

Należy uwzględnić wiele kryteriów przy wyborze odpowiedniego układu rozdzielającego. W chromatografii i technikach pokrewnych najważniejszy jest dobór fazy ruchomej i fazy stacjonarnej w odniesieniu do oznaczanych analitów. Mechanizm retencji oparty jest bowiem na specyficznych i niespecyficznych oddziaływaniach, a jednym z najważniejszych parametrów jest, obok wszystkich okoliczności, bez wątpienia masa cząsteczkowa (Mw) analitu. Zakres stosowalności technik rozdzielania (rys. 1) daje analitykowi olbrzymie narzędzie, dzięki czemu ich przenikanie się i uniwersalizm to niemalże wyzwanie ze względu na realizację zaplanowanego eksperymentu.

Już sto lat temu odkrywca chromatografii Michał S. Cwiet- profesor Uniwersytetu Warszawskiego [7]- zauważył, że kolumna odgrywa dominującą rolę w układzie rozdzielającym. To prawda, że jej kształt i gabaryty odbiegają od tych, jakie wykorzystuje się powszechnie w przypadku rutynowych oznaczeń (rys. 2). Jednakże wymagania, co do selektywności, rozdzielczości i odtwarzalności danych retencyjnych, pozostają w tym samym zakresie oczekiwań i wymagań jak przed laty. W technologii wypełnień i kolumn nastąpił bowiem na przestrzeni ostatnich lat największy postęp w chromatografii, a zastosowanie ich w szerokim spektrum oznaczeń stanowi potwierdzenie tej tezy.

Uwagę należy również zwrócić na dynamiczny rozwój sprzętu umożliwiającego wykonywanie analiz próbek bardzo skomplikowanych. Ewolucja w tym zakresie również miała swoje odzwierciedlenie w rozwoju oprzyrządowania (urządzenia peryferyjne), jak i oprogramowaniu, tak by oznaczenie skomplikowanych mieszanin mogło być obarczone jak najmniejszym błędem (rys. 3). Oczywiście, jakość wyników i cena są tu bezdyskusyjne, ale jest to też konsekwencja czasu.

Niniejszy rozdział stanowi krótkie podsumowanie właśnie tego, co osiągnięto w technologii wypełnień i kolumn do chromatografii i technik pokrewnych. Autorzy będą starali się przedstawić kierunki rozwoju i możliwości zastosowania zdobytych osiągnięć w różnych wariantach śladowej analizy chemicznej.






Rys. 1 Zakres zastosowania technik chromatograficznych gdzie: GC –chromatografia gazowa, TLC –cienkowarstwowa chromatografia cieczowa, HPLC- wysokosprawna chromatografia cieczowa, GPC – chromatografia wykluczania, IC – chromatografia jonowa, ITP - izotachoforeza , CZE – kapilarna elektroforeza strefowa, FFF – technika frakcjonowania przepływowego w polu grawitacyjnym






A


B

F

G



Rys. 2 Schematyczne przedstawienie procesu ewolucji kolumn do chromatografii cieczowej: A) kolumna według Cwieta z lat 1903-1908 [7], B) kolumna według Sthal’a [2], C) konwencjonalna kolumna analityczna (250 x 4.6 mm ID), D) kolumna o zmniejszonej średnicy (250 x 1.0 mm ID), E) mikro-kolumna (100 μm x 250 mm ID), F) kolumna preparatywna (250 x 45 mm ID), G) kolumna w postaci chipa (50 x 50 μm)










Rys. 3 Ewolucja aparatury do chromatografii cieczowej: A) pierwowzór urządzenia wg Cwieta wraz z chromatogramami, B) wielokolumnowy chromatograf cieczowy wg Cwieta, C) współczesne połączenie chromatografu cieczowego ze spektrometrem mas



2. EWOLUCJA WYPEŁNIEŃ I KOLUMN

U progu XXI wieku poszukuje się układów modelowych, które odpowiadałyby tym występującym w przyrodzie. Dzięki nim możliwe jest odsłanianie tajemnic “innego świata” i wyjaśnianie zjawisk, które dotychczas nie zostały lub nie mogły być poznane. Odnosi się to zwłaszcza do procesów jednostkowych zachodzących w organizmach żywych (zarówno w świecie roślinnym, jak i zwierzęcym). Zagadnienia te, jako ważne z naukowego i praktycznego punktu widzenia, skłoniły badaczy do poszukiwania nowej generacji wypełnień i kolumn („na miarę” - jakby dedykowanych) oraz zminiaturyzowanych układów rozdzielających (mikro-kolumny, mikro-pręty, kapilary i nanorurki) do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i technik jej pokrewnych tj. ekstrakcji w układzie ciecz – ciało stałe (SPE) czy ekstrakcji do fazy stacjonarnej (SPME), denudacji, elektrochromatografii (CEC) lub też strefowej elektroforezy kapilarnej (CZE) i jej licznych odmian. Zaletą tych układów jest to, że materiały te, ze względu na ich unikalne właściwości konstrukcyjne, można zastosować zamiennie w różnych fizykochemicznych metodach rozdzielania [1,2,4,8-10].

Mimo sukcesywnego wprowadzania nowych materiałów eksploatacyjnych do chromatografii i technik pokrewnych takich, jak: polimery porowate [11,12], węgle [13,14], adsorbenty złożone (karbosile) [15,16] oraz czyste i modyfikowane tlenki glinu, cyrkonu i tytanu [14,17,18], to nadal podstawową grupę stanowią wypełnienia z chemicznie związanymi fazami na bazie adsorbentów krzemionkowych [1,2,9,14]. Ich fizykochemiczne właściwości, takie jak: typ i struktura matrycy, porowatość, typ i stężenie powierzchniowych grup hydroksylowych oraz czystość powierzchni (obecność zanieczyszczeń metalicznych – heteroatomów) były przedmiotem intensywnych i szczegółowych studiów [1,2,14,19,20]. Dzięki temu możliwe było wyjaśnienie wielu istotnych zjawisk i efektów mających wpływ nie tylko na procesy związane z rozdzielaniem analitów, ale również wyjaśnienie mechanizmów decydujących o formowaniu się przypowierzchniowego filmu (tworzenie wiązań pomiędzy nośnikiem a modyfikatorem, solwatacja powierzchni wypełnień przez molekuły składników fazy ruchomej, lokalna zmiana stężenia składników, itd.). Opracowane dotychczas fazy stacjonarne [14] można zaszeregować bazując na tych zdobyczach do sześciu podstawowych grup (rys. 4).

W grupie tej wyróżnić można zarówno fazy o strukturze monowarstwy – „monomer” (rys. 4a) (uzyskane za pomocą monofunkcyjnego modyfikatora, F = 1) jak i poliwarstwy – „polimer” (rys. 4b) (F = 1-3) czy strukturze kanapkowej (Rys. 4c), gdzie w wyniku wieloetapowej polimeryzacji tworzy się „podłoże”, a następnie przeprowadza się końcową modyfikację. Najnowsze rozwiązania orientują w kierunku preparatyki wypełnień z tzw. barierą dyfuzyjną (np. w hydrofobowym łańcuchu wbudowane są polarne ugrupowania) (rys. 4d) czy wreszcie różnego rodzaju fazy mieszane (Rys. 4e i 4f) zawierające różne specyficzne grupy funkcyjne.



monowarstwa



struktura z barierą dyfuzyjną



poliwarstwa



fazy mieszane

struktura „kanapkowa” (ang. sandwich)


Rys. 4 Klasyfikacja chemicznie związanych faz stacjonarnych według [14]


W chromatografii z odwróconym układem faz (RP HPLC) najbardziej rozpowszechnionymi wypełnieniami stosowanymi w rutynowych oznaczeniach farmaceutycznych, klinicznych, biochemicznych czy dla potrzeb analizy środowiskowej i produktów żywnościowych są krzemionki modyfikowane hydrofobowymi łańcuchami węglowodorowymi o różnej długości (C2, C8, C18, C22 czy C30) [1,19,21,22]. Często bywa tak, że stosując komercyjne wypełnienia podczas rozdzielania analitów o charakterze polarnym (kwasowym lub zasadowym), nie uzyskuje się satysfakcjonujących rezultatów. Przejawem tego jest zła rozdzielczość pasm czy też pik odbiega kształtem od typowego pasma gaussowskiego (współczynnik asymetrii 0.95 ≥ fAs  1.25). W konsekwencji pasmo takie wykazuje tzw. ogonowanie, które może być spowodowane pewną populacją heteroatomów [20,23], ale też i obecnością nierównomiernie rozmieszczonych na powierzchni nośnika silanoli (tzw. łysiny). Stąd też, w celu poprawienia kształtu pików, a tym samym rozdzielczości, wprowadzono wypełnienia z tzw. gęstym i kontrolowanym pokryciem powierzchni za pomocą chemicznie związanej fazy [1,21]. Utworzony film powinien lepiej ekranować resztkowe silanole, co determinuje selektywność (α) [1,2], której miarą jest rozdzielczość (RS):
(1)
gdzie: N – ilość półek teoretycznych, α – selektywność (α = k2/k1), k – współczynnik pojemnościowy

W przypadku rutynowych oznaczeń chromatograficznych, obok wspomnianych wcześniej hydrofobowych wypełnień C18, C8, czy C30, stosuje się również fazy z polarnymi grupami funkcyjnymi tj: -NH2, -NO2, -CN, aryl-, itd. [1,2] (rys. 5). Przy czym należy tu zaznaczyć, że pomimo upływu czasu i postępu, krzemionka jest nadal najbardziej popularnym nośnikiem dla chemicznie związanych faz [1,14,19,23].







sialnole związane



Wiązania siloksanowe

Wolne silanole

silanole bliźniacze


Rys. 5 Chemiczne związane fazy stacjonarne na bazie żelu krzemionkowego stosowane w chromatografii cieczowej i technikach pokrewnych


Mimo że przedstawione powyżej wypełnienia mają „uniwersalny charakter” i stosunkowo szeroki zakres zastosowań, to jednak złożoność czynników fizykochemicznych wpływających na retencję substancji chromatografowanych wymusza poszukiwanie nowych faz stacjonarnych o specyficznych i selektywnych właściwościach. W tym miejscu należy zauważyć, że wg raportu opublikowanego w czasopiśmie LC-GC [24] na świecie istnieje ponad 200 liczących się producentów kolumn i materiałów separacyjnych (wypełnienia, chipy, SPE, membrany), a roczne zapotrzebowanie światowego rynku na kolumny analityczne do HPLC ocenia się na ponad 150 tys. sztuk o wartości ponad 500 mln USD. Przykład ten w zupełności wyjaśnia zainteresowanie- zarówno producentów, jak i użytkowników – poszukiwaniem nowych opracowań [25].

3. NOWE FAZY STACJONARNE DO CHROMATOGRAFII

I TECHNIK POKREWNYCH.
Istnieje wiele metod modyfikacji powierzchni adsorbentów stosowanych jako nośniki chemicznie związanych faz stacjonarnych. Biorąc pod uwagę fakt, że krzemionka jest najbardziej rozpowszechnionym nośnikiem, w literaturze dominują dwa sposoby chemicznej modyfikacji jej powierzchni. Jeden polega na hydrosililacji atomów krzemu zlokalizowanych w wiązaniach siloksanowych (Si-O-Si) [1,14,20]. W przypadku drugiego - tradycyjnego, gdzie różnego rodzaju organosilany zawierające aktywne grupy: chloro-, metoksy-, etoksy- czy amino- są chemicznie wiązane z powierzchnią nośnika [26-27]. Szczegółowy opis warunków procesu modyfikacji oraz komentarz do formowania cienkich filmów na powierzchni nośników można znaleźć w licznych opracowaniach [1,14,21,23,28,29].

Rozdzielanie w przypadku techniki RP HPLC i technik pokrewnych realizowane jest w warunkach hydroorganicznych, najczęściej z zastosowaniem faz hydrofobowych o różnej długości łańcucha i przypowierzchniowej strukturze związanych ligandów. Daje ona dobre wyniki w przypadku oznaczania substancji o charakterze niepolarnym lub słabo polarnym. Osiągnięcie zadowalających rezultatów podczas rozdzielania mieszanin związków o silnie zasadowym lub kwasowym charakterze staje się trudne. Wynika to ze specyficznych i niespecyficznych oddziaływań oraz interferencyjnych i preferencyjnych zjawisk towarzyszących procesom jednostkowym przebiegającym na granicy faz. Stąd często, w przypadku skomplikowanych analiz wymagane jest stosowanie wypełnień o właściwościach mieszanych (np. hydrofobowo – hydrofilowych) [1,5,9,30], czym jednocześnie można wyjaśnić poszukiwanie nowych faz stacjonarnych np. imitujących naturalne układy biologiczne (błony biologiczne) [9,10]. Wiąże się to z oczekiwaniami, jaką rolę takie sztuczne układy miałyby spełniać w stosunku do substancji rozdzielanych. Błona biologiczna z założenia winna bowiem:



  • stanowić naturalną granicę między środowiskiem zewnętrznym a wewnętrznym komórki,

  • być miejscem występowania systemów transportujących pozwalających na kontrolowany przepływ różnych związków chemicznych,

  • być siedliskiem białek będących czujnikami na zmiany w otoczeniu,

  • stanowić naturalny przetwornik energii.

Dzięki sztucznym układom możliwe jest modelowanie drogi migracji ksenobiotyków do wnętrza komórki i ich kumulowania się, a w konsekwencji modelowanie nowej generacji leków czy kosmetyków, eliminując tym samym drogie i niehumanitarne doświadczenia na zwierzętach. Krzemionka modyfikowana związkami wchodzącymi w skład błon biologicznych (cholesterol, fosfolipidy) z powodzeniem może spełniać rolę układu modelowego (rys.6).

W roku 1989 po raz pierwszy [31] zaproponowano nową generację wypełnień typu immobilizowanej sztucznej membrany (IAM), gdzie cząsteczki fosfolipidu kowalencyjnie przyłączone zostały do powierzchni krzemionkowego nośnika (rys.7). Preparatyka tego typu fazy stacjonarnej wymaga skomplikowanej wieloetapowej syntezy, by w rezultacie uzyskać strukturę, dzięki której możliwe jest efektywne rozdzielanie niskocząsteczkowych białek (albumina, paracelsyna).

Analizując strukturę rozpatrywanej fazy widać, że spełnia ona wymagania stawiane modelowym materiałom imitującym naturalne błony, dzięki czemu kolumny te z dużym powodzeniem zalecane są dla potrzeb analityki farmaceutycznej, medycznej, biochemicznej. Podobnymi właściwościami, jednakże o nieco odmiennej selektywności, cechują się wypełnienia zaproponowane w kilku pracach [9,32], zawierające obok resztkowych silanoli również ugrupowania N-amidowe wbudowane w hydrofobowy łańcuch C16 lub molekuły cholesterolu (rys.8A).


Rys. 6 Budowa fazy stacjonarnej do chromatografii cieczowej imitująca naturalną błonę biologiczną


Fazy te również z powodzeniem zastosowane zostały do rozdzielania szerokiej gamy indywiduów o zróżnicowanej budowie i polarności, należących do różnych grup związków (leki, aminokwasy, białka, sterydy, węglowodory czy aminy) [9,32,33]. Interesujące jest, że dzięki zastosowaniu chemometrii, a zwłaszcza modelowaniu molekularnemu, wykorzystując dane z analizy chromatograficznej, możliwe jest określanie udziału poszczególnych grup w mechanizmie retencji. Uwzględniając dodatkową interesującą cechę, jaką są chiralne centra zlokalizowane w związanych ligandach fazy stacjonarnej. Na rysunku 8 B przedstawiony został rezultat rozdzielania izomerów 22S- i 22R-Budesonidu® z wykorzystaniem cholesterolowej fazy stacjonarnej, co nie było możliwe w przypadku zastosowania konwencjonalnych kolumn oktadecylowych [9].
  1   2   3   4


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna