I technikach pokrewnych u progu XXI. Quo Vadis Chromatographia?



Pobieranie 160.12 Kb.
Strona2/4
Data30.04.2016
Rozmiar160.12 Kb.
1   2   3   4

W literaturze zostały też opisane fazy o tzw. inteligentnej powierzchni (z ang. smart surfaces) [34], które wg zamysłu autorów miały stanowić alternatywne układy do separacji związków optycznie-czynnych. Fazy te, zawierające w swojej strukturze białka, takie jak albumina osocza bydlęcego (BSA) lub albumina osocza ludzkiego (HSA) czy keratyna miały umożliwić dogodne przejście do modelowania naturalnych układów biologicznych (diastereoizomerów tryptofanu i kinureniny) [35]. Okazało się jednak, że bariera techniczna, pomimo spełnienia wszelkich teoretycznych założeń, uniemożliwia uzyskanie powtarzalnych wypełnień. Podobnie było z keratyną [36], która ze względu na swoją specyficzną budowę (struktura „helisy” – jak w modelu DNA Watsona–Cricka - czy struktura „daszka”) wydawała się być wyjątkowo dedykowana do separacji produktów naturalnych (białka, aminokwasy, itd.)


Ważną grupę wypełnień o szerokim zastosowaniu w różnych technikach separacyjnych (HPLC, CZE, SPE, GC) stanowią fazy chiralne Pirkla [14], w których dominującymi oddziaływaniami są donorowo-akceptorowe i - oraz fazy cyklodekstrynowe, jako pierwsze opracowane również w Polsce [37], a z dużym powodzenie rozwijane przez inne zespoły [38, 39]. Dzięki tym materiałom możliwe jest rozdzielanie i preparatywne wyodrębnianie związków optycznie czynnych (chiralnych) jako źródła informacji przy określaniu składników aktywnych biologicznie. Ma to ogromne znaczenie dla potrzeb przemysłu farmaceutycznego i kosmetycznego.

CDI – karbonylodiimidazol

SPA – grupa aminopropylowa – żel krzemionkowy

B

C

Rys. 7 Schemat wieloetapowej syntezy fazy fosfolipidowej (A) i możliwości jej zastosowania w rozdzielaniu białek: paracelsyny (B), albuminy i owoalbuminy (C)



Faza alkiloamidowa

Faza cholesterolowo-alkiloamidowa

1. Desonid

2. 22R Budesonid

3. 22S Budesonid

22S Budesonid

22R Budesonid

Czas (min.)



Rys. 8 Modele cholesterolowej i cholesterolowo-amidopropylowej fazy stacjonarnej oraz przykład rozdzielania izomerów budesonidu z wykorzystaniem fazy cholesterolowej jako fazy stacjonarnej; faza ruchoma: acetonitryl-woda 32/68 v/v, przepływ: 1 ml min-1, detekcja: UV-Vis λ=254 nm
Do rozdzielania fullerenów (C60, C70, C76, C84) w warunkach niewodnych [40] zastosowano donorowo-akceptorowe wypełnienia zawierające różne grupy funkcyjne, a zwłaszcza atomy fluoru rozmieszczone w pierścieniu benzenowym. Fazy te z powodzeniem zostały również zastosowane do analizy dioksyn. Do rozdzielania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) [41, 43] zaproponowano szeroką gamę wypełnień, gdzie dominującymi były oddziaływania π…….π. Prace te zapoczątkowały badania nad preparatyką wypełnień ze związanymi fullerenami [41,43] (rys. 9A). Wyjątkową selektywnością w stosunku do fullerenów charakteryzuje się faza porfirynowa (rys. 9B). Dzięki metaloorganicznemu połączeniu (Zn+porfiryna) uzyskano wyjątkową selektywność pomiędzy analitem a związanym ligandem [42,44].

Innym rodzajem wypełnień stosowanych zarówno w chromatografii gazowej, jak i cieczowej są fazy ciekłokrystaliczne [45]. Ciekłe kryształy są grupą związków o właściwościach pośrednich pomiędzy cieczą a ciałem stałym. Stabilne fazy ze związanymi ciekłymi kryształami zostały z powodzeniem zastosowano w praktyce analitycznej [46,47] do rozdzielania mieszaniny płaskich molekuł, jakimi są anality z grupy WWA. Uzyskane wyniki wskazują, iż na tych materiałach ma miejsce lepsze „rozróżnianie” planarności i kształtu niż na typowych fazach oktadecylowych [46,47]. Należy dodać, że wiele faz organicznych (zwłaszcza te o wyższych masach cząsteczkowych) wykazuje właściwości zbliżone do faz ciekłokrystalicznych [48]. Obszerny przegląd tej grupy materiałów został opublikowany w jubileuszowym wydaniu czasopisma Chemia Analityczna [45].



A

Żel krzemionkowy




B

Żel krzemionkowy


Rysunek 9 Budowa tetraporfirynowej faza stacjonarnej do rozdzielania fullerenów (A) [42] oraz fullerenowa faza stacjonarna (B) [43,44]


4. ADSORPCJA CZY PODZIAŁ? ODWIECZNY PROBLEM
Niezwykle ważne przy preparatyce nowych faz stacjonarnych jest określenie ich struktury i właściwości. Wiąże się to z opisem mechanizmu retencji i ma to istotne znaczenie w określeniu selektywności. Stosowane są do opisu topografii faz różnego rodzaju techniki fizykochemiczne takie, jak: spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR), spektroskopia NMR z polaryzacją skrośną z wirowaniem pod kątem magicznym (CP MAS NMR) zarówno dla 29Si jak i 13C, mikroskopia elektronowa, tunelowa i atomowa, metody termograwimetryczne (TGA, DSC, analiza elementarna) czy wykorzystujące niskotemperaturowe zjawisko adsorpcji-desorpcji np.: azotu (porozymetria) [21,22,26]. Ważnym zagadnieniem przy omawianiu charakterystyki wypełnień i kolumn chromatograficznych jest ich właściwa ocena. Problem w tym, że komercyjna kolumna, poddana takiej ocenie, zostałaby trwale uszkodzona. Aby uniknąć tej drastycznej czynności w literaturze można znaleźć wiele testów chromatograficznych, na podstawie których w oparciu o międzycząsteczkowe oddziaływania analit  faza stacjonarna  faza ruchoma możliwa jest ocena ich jakości i przydatności do danego typu analizy. Pionierem w tym zakresie był Knox i Bristow [49], którzy w swojej fundamentalnej pracy zwrócili uwagę na doniosłość tego faktu. W swoich rozważaniach przedstawili analizę bazującą na empirycznych, statystycznych i dynamicznych modelach. O aktualności i ważkości zagadnień świadczy fakt, że problem jest nadal nie rozwiązany i stanowi przedmiot intensywnych poszukiwań wielu badaczy [22,25,50-61]. Najpopularniejsze testy chromatograficzne stosowane do oceny właściwości faz stacjonarnych oraz opisu mechanizmu retencji zestawiono w tabeli 1.
Tabela 1 Testy do oceny jakości kolumn chromatograficznych


TEST

CHARAKTERYSTYKA TESTU

ZAŁOŻENIE

Knox i Bristow
[49]

Określenie podstawowych parametrów charakteryzujących jakość kinetyczną (sprawność) i statyczną kolumny

Liczba półek teoretycznych: N=5.54(tR/wt)2
Wysokość równoważna półce teoretycznej: H=L/N
Liniowa prędkość fazy ruchomej: u=L/t0
Współczynnik pojemnościowy:
k=(tR-t0)/t0
Indeks sprawności: =N2/(tRΔp)
Współczynnik Knoxa-Parchera: I=dc/Ldp
Przepuszczalność kolumny:
κ = (ηL2)/(Δpt0)
(tR-czas retencji, wt-szerokość piku w połowie wysokości,
L-długość kolumny, t0-czas martwy, Δp-spadek ciśnienia w kolumnie,
dc-średnica kolumny, dp-wielkość ziarna nośnika fazy stacjonarnej,
η-lepkość fazy ruchomej)

Engelhardt
[51,52]

Anality testowe: uracyl (t0), anilina, fenol,
N,N-dimetyloanailina, p-etyloanialina, toluen, etylobenzen.
Eluent: MeOH/H2O 55/45 v/v; temp. 40˚C.
 = 254 nm;

Anality testowe: uracyl (t0), trifenylen,


o-tertfenyl.
Eluent: MeOH/H2O 75/25 w/w, temp. 40˚C.
 = 254 nm;

Hydrofobowość (hydrophobicity)
= ketylobenzen / ktoluen; Aktywność silanolowa (z ang. silanol activity)
= współczynnik asymetrii
p-etyloanailiny w 5% wysokości

Selektywność względem kształtu


(z ang. shape selectivity)
= ktrifenylen / ko-terfenyl.

Walters
[53]

Anality testowe: uracyl (t0), benzen, antracen.
Eluent: ACN/H2O 65/35v/v; temp. 40˚C.
 = 254 nm.

Anality testowe: uracyl (t0),


N,N-dietylo-m-toluamid (DETA), antracen. Eluent: 100% ACN, temp. 40˚C.
 = 254 nm.

Hydrofobowość = kantracen / kbenzen

Aktywność silanolowa =


kDETA / kantracen

Tanaka
[54]

Anality testowe: uracyl (t0), tiourea (t0), amylobenzen, butylobenzen, trifenylen,
o-terfenyl, kofeina, fenol, benzyloamina.
Eluent: MeOH/H2O 80/20 v/v

Eluent: MeOH/H2O 30/70 v/v

Eluent: MeOH/0.02M bufor fosforanowy (pH=7.6) 30/70 v/v

Eluent: MeOH/0.02M bufor fosforanowy (pH=2.7) 30/70 v/v



Hydrofobowość =
kamylobenzen / kbutylobenzen
Ilość ligandów alkilowych = kamylobenzen
Selektywność steryczna
= ktrifenylen / ko-terfenyl

Charakter wiązania wodorowego
(z ang. hydrogen bond capacity)
= kkofeina kfenol
Charakter wymiany jonowej
(z ang. ion exchange capacity-IEC) w pH>7 = kbenzyloamina/kfenol

IEC w pH<3 = kbenzyloamina /kfenol.



Daldrup
& Kardel
„test DMD”
[55]

Anality testowe: difenylodramina,
5-(p-metylofenylo)-5-fenylohydantoina (MPPH), diazepam.
Eluent: 156g ACN + 340g buforu fosforanowego pH=2.3.
=221nm.

Testowanie przydatności kolumn do klinicznych i sądowych analiz toksykologicznych; niska aktywność silanolowa – kdifenylodramina < kMPPH;
wysoka aktywność silanolowa – kdifenylodramina > kdiazepam, niesymetryczne piki;

Sander i Wise [27,56]

Anality testowe: benzo[a]piren (BaP),
fenantro[3,4-c]fenantren (PhPh), tetrabenzonaftalen (TBN).
Eluent: ACN/H2O 85/15, przepływ 2 ml/min.
=254nm.

Testowanie selektywności kolumn, dla kolumn monomerycznych TBN/BaP > 1.7 (wysoka selektywność względem kształtu), polimerycznychTBN/BaP < 1 (niska selektywność względem kształtu), oligomeryczne
1 < TBN/BaP < 1.7

Buszewski
i współpr.
[57]

Anality testowe: uracyl (t0), bronopol, acetofenon, benzen, toluen
Eluent: ACN//H2O 80/20; =254nm
Anality testowe: uracyl (t0), bronopol
Eluent: woda 100%.
=221nm.

Selektywność bronopolu jako indykatora gęstości pokrycia fazy stacjonarnej, rozdzielczości i „długości życia” kolumny

Kaliszan
[59-61]

Anality testowe o różnej strukturze i parametrach fizykochemicznych

Identyfikacja czynników strukturalnych wpływających na oddziaływania cząsteczek analitu z chemicznymi składowymi układu chromatograficznego

Galushko
[74]

Anality testowe: uracyl (t0), fenol, benzen, toluen

Eluent: MeOH/H2O 60/40 v/v; temp. 30oC; =254nm.


Hydrofobowość = 0.5(ktoluen+kbenzen);
Selektywność hydrofobowa liczona na podstawie retencji fenolu, toluenu
i benzenu;
Aktywność silanolowa = 1+3[(kanilina/kfenol)-1];
Selektywność względem rozmiaru
(z ang. Size selectivity) liczona na podstawie retencji fenolu, toluenu
i benzenu

Jandera
i Buszewski
[75]


Anality testowe: kwasy naftalenosulfonowe

Faza ruchoma: 0.4M Na2SO4


Retencja analitów zależy od homogenności pokrycia powierzchni nośnika fazy stacjonarnej chemicznie związanymi ligandami oraz formowania się dwuwarstwy elektrycznej. Selektywność stanowi wskaźnik aktywności silanolowej fazy stacjonarnej.

Spośród wielu testów na szczególna uwagę zasługuje metoda poświęcona badaniom jakościowej zależności struktury – retencja chromatograficzna tzw. QSRR (ang. Quantitative Structure – Chromatographic Retention Relationships) [62]. Bazując na metodologii QSRR można zidentyfikować strukturalne czynniki wpływające na oddziaływania molekuł analitu z chemicznymi składowymi systemu chromatograficznego. Wychodząc z podstawowego równania: Soczewińskiego-Wachtmeistera [63]:


logk = logkwsφ (2)

oraz Abrahama [64]:


log SP = c + rR2 + p2H + a2H + b2H + vVx (3)
gdzie: k – współczynnik retencji; kw – wartość współczynnika retencji ekstrapolowanego do wartości odpowiadającej w czystej wodzie; φ – zawartość modyfikatora organicznego; s – wartość stała; SP – względna rozpuszczalność otrzymana dla danej serii analitów testowych (k w RP HPLC); R2 – nadmiarowa refrakcja molowa; 2H – dipolarność/polaryzowalność analitu; 2H – kwasowość wiązania wodorowego; 2H zasadowość wiązania wodorowego; Vx – charakterystyczna objętość McGovana [65]

Rozważa się trzy podstawowe rodzaje zależności dla serii dobrze zdefiniowanych związków testowych, o zróżnicowanych właściwościach [66]:




  • log kw = f (log P)

  • logkw = f (R2, 2H, 2H, 2H, Vx)  retencja a parametry solwatochromowe Abrahama;

  • logk = f (min, 2, SAS)  retencja a deskryptory strukturalne obliczone z zastosowaniem modelowania molekularnego

gdzie: log P – logarytm ze współczynnika podziału między n-oktanol i wodę stosowany jako referencyjny parametr hydrofobowości związków; min – nadmiarowy ładunek elektronowy na atomie;  – moment dipolowy; SAS – powierzchnia dostępna dla cząsteczek rozpuszczalnika.
Równania QSRR dobrze obrazują specyficzne właściwości retencyjne poszczególnych faz stacjonarnych. Wieloparametrowa analiza regresyjna poprawnych statystycznie równań prowadzi do wniosków dotyczących mechanizmów rządzących rozdzielaniem w poszczególnych systemach chromatograficznych. Bazując na powyższych równaniach można dokonywać porównawczej analizy kolumn. Przykładem niech będą kolumny zawierające: cząsteczki cholesterolu (SG-Chol), kolumna typu immobiliowana sztuczna membrana (SG-IAM) oraz klasyczne, hydrofobowe kolumny oktadecylowe (SG-POLY). Wyższa wartość współczynnika korelacji dla faz SG-Chol względem SG-POLY (r = 0.9618) w stosunku do odpowiedniego współczynnika dla fazy SG-Chol względem. SG-IAM (r = 0.9264) przemawia za podobieństwem tych układów do naturalnych (rys. 10).


log kw SG-Chol


Rysunek 10 Zależność log kwSG-Chol względem logkwSG-IAM i log kwSG-Chol względem logwSG-POLY


Jest to zgodne z oczekiwaniami, gdyż związany ligand w fazie SG-IAM ze względu na obecność polarnych fragmentów wnosi specyficzny wkład w retencje. Gorsza korelacja log kw SG-Chol względem log kw SG-IAM w stosunku do log kw SG-Chol względem log kw SG-POLY uzasadnia wyższą hydrofobowość na fazie cholesterolowej. Dzięki temu, fazy te mogą one być przydatne do przewidywania niektórych rodzajów aktywności farmakologicznej bądź nowej generacji leków [9].

Z rozwiązania równań można wnioskować, jaki typ oddziaływań, a w konsekwencji, jaki mechanizm dominuje podczas procesu rozdzielania chromatograficznego. Dlatego też w sensie fizycznym adsorpcja i podział różnią się diametralnie, a jednoznaczne zdefiniowanie mechanizmu retencji w chromatografii za pomocą jednego z tych modeli jest kontrowersyjne [5,34,67-70]. Adsorpcja ma miejsce na granicy adsorbującego ciała stałego (faza stacjonarna) i fazy ciekłej. Podział powoduje transport molekuł związku wbudowanego między łańcuchy fazy stacjonarnej między dwoma nie mieszającymi się roztworami [71]. Ponieważ powierzchnia fazy stałej powinna być zsolwatowana przez molekuły fazy ruchomej, nie można opisać mechanizmu retencji tylko za pomocą podziału lub adsorpcji. Zaproponowano [67] alternatywne rozwiązanie (tzw. displacement model), gdzie retencja może być rozważana jako podział i przemieszczenie. Rozważania matematyczne w dużym stopniu wyjaśniają związek między retencją a hydrofobową budową analitów i zależnością selektywności metylenowej, która jest funkcją właściwości fazy ruchomej i stacjonarnej, z pominięciem natury analizowanego związku [67,70,72,73]. Za niejednoznacznym, mieszanym mechanizmem retencji przemawiają również zależności parametrów Hansch’a w funkcji selektywności metylenowej [9,74].



1   2   3   4


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna