I technikach pokrewnych u progu XXI. Quo Vadis Chromatographia?



Pobieranie 160.12 Kb.
Strona3/4
Data30.04.2016
Rozmiar160.12 Kb.
1   2   3   4

5. MINIATURYZACJA

Od kilku lat dominujące miejsce w literaturze chromatograficznej zajmuje poszukiwanie rozwiązań umożliwiających miniaturyzację układów separacyjnych. Początki znowu dała tu chromatografia gazowa i opracowania Golay’a [2,3]. Po wielu próbach i w tej dziedzinie można zaobserwować znaczący postęp (jeśli chodzi o chromatografię cieczową). Wyróżnić tu można dwa główne kierunki: układy kolumnowe i planarne (ang. chip) (Rys. 11).



Pierwszy dotyczy miniaturyzacji kolumn, a w szczególności zmniejszenia ich średnicy wewnętrznej (ang. narrow bore column) oraz możliwości zastosowania w chromatografii z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym (SFC), chromatografii gazowej (GC) i technikach elektromigracyjnych takich jak elektrochromatografia (CEC). Parametry, które jednoznacznie przemawiają za stosowaniem mikrokolumn w porównaniu do kolumn o zmniejszonej średnicy i tych klasycznych zebrano w tabeli 2.
Tabela 2 Porównanie parametrów chromatograficznych kolumn do chromatografii cieczowej

Parametr

Jednostka


Typ kolumny (długość, mm  I.D. mm)

Konwencjonalna


(250  4.6)

O zmniejszonej średnicy

(250  1.5)

Mikro-kolumna


(250  0.5)

Prędkość liniowa fazy ruchomej (u)

mm/s

1.4

1.4

1.4

Natężenie przepływ (F)

ml/min

1.0

0.1

0.01

Objętość piku (Vp)

l

116

12

1.4

Wysokość piku (Cmax)

%

1.2

12

100

Zużycie fazy ruchomej w ciągu 7 godzin

ml

420

42

4.2



MINIATURYZACJA UKŁADÓW ROZDZIELAJĄCYCH

UKŁADY PLANARNE - CHIPY


TECHNIKI KOLUMNOWE

Kolumny monolityczne


Kolumny kapilarne otwarte

CEC

HPLC

CZE

SFC

CEC

CZE

Rys. 11. Główne kierunki rozwojowe w zakresie miniaturyzacji układów rozdzielających.
Z powyższego zestawienia widać, że zachowując laminarny charakter przepływu strumienia fazy ruchomej we wszystkich rozpatrywanych przypadkach (u = 1.4 mm/s) współczynnikiem charakterystycznym jest współczynnik 100. Odnosi się to zarówno do tak ważnych parametrów jak wielkość piku, parametrów związanych ze sprawnością kolumny wyrażoną ilością półek teoretycznych. Dzięki takiemu podejściu w wyniku optymalizacji warunków preparatyki kolumn pakowanych (zmiana składników układu dyspersyjnego używanego w preparatyce zawiesiny fazy stacjonarnej – slurry) możliwe było uzyskanie sprawności bliskich h = 2.2 dla kolumn pakowanych o uziarnieniu dp = 5 m (Rys. 12).

A)



B)

Rys. 12 Zależność van Deemter’a otrzymana po optymalizacji procedury pakowania mikro-kolumn (100μm x 250mm) (A), chromatogram uzyskany w trakcie rozdzielania mieszaniny 16 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w warunkach elucji izokratycznej (B)


Wysoka rozdzielczość pomiędzy poszczególnymi pikami mieszaniny testowej (16 analitów z grupy WWA według US EPA) uzyskana w warunkach elucji izokratycznej jednoznacznie wskazuje kierunki dalszych badań. Oczywiście „wąskim gardłem” są spieki odpowiedzialne za stabilność złoża wypełnienia, zdolność penetracji ziaren złoża wynikającą z homogenności ich ułożenia i będącą konsekwencją zastosowania odpowiednich procedur preparowania kolumn [4,71]. Dlatego też najnowsze badania zamierzają w kierunku uzyskania tzw. kolumn monolitycznych, dzięki którym eliminuje się powyższe niedogodności [4].

Tanaka z zespołem [77] jako pierwszy wprowadził tego typu rozwiązania dla krzemionkowych złóż monolitycznych poddając etoksysilany wieloetapowej polimeryzacji. Uzyskane zostały kolumny, które z powodzeniem wykorzystano zarówno w HPLC jak i w CEC. Niedogodnością tych kolumn, podobnie jak i wypełnień krzemionkowych, jest niska odporność solwolityczna (pH = 2.2 – 7.5). Dlatego też inni badacze [4,78,79] uwagę swoją skoncentrowali na preparatyce kolumn polimerowych, stabilnych zarówno mechanicznie, jak i solwolitycznie. Uzyskane w wyniku foto- lub termopolimeryzacji (np. metakrylanów metylu) złoża możliwe jest modyfikować w różnoraki sposób wprowadzając do struktury polimeru różne grupy funkcyjne [4,79]. Ta właściwość daje możliwość uzyskania kolumn dedykowanych (ang. finger print) polimerów z nadrukiem molekularnym (ang. Molecularly Imprinted Polimer - MIP) [79,80] (rys.13).





Rys. 13 Zastosowanie wypełnienia polimeru z nadrukiem molekularnym (Molecularly Imprinted Polimer – MIP) w rozdzielaniu izomerów propranololu z wykorzystaniem mikro-HPLC
Oczywiście, że zarówno w przypadku kolumn polimerowych, jak i krzemionkowych, dominującą rolę odgrywa homogeniczność połączenia pomiędzy złożem a ścianą kolumny (właściwy sposób modyfikacji ścian [4,79] oraz jednorodna struktura porowata uformowanego, w wyniku polimeryzacji na całej długości kolumny złoża (rys. 14). Prawidłowo przeprowadzona polimeryzacja znacznie skraca czas oznaczania indywiduów. Ma to swoje odzwierciedlenie zarówno w sprawności i selektywności rozdzielanych analitów.

Specyfika modyfikacji ścian kolumny kwarcowej dla potrzeb separacji elektrochromatograficznych, dzięki czemu możliwe jest formowanie przepływu elektroosmotycznego (z ang. electroosmotic flow - EOF) przy jednoczesnym sterowaniu długością kolumny, dała możliwość oznaczania nie tylko związków chemicznych obdarzonych ładunkiem. Modyfikacja układu rozdzielającego (dodatek jonogennych soli, lub surfaktantów) czy układu detekcyjnego pozwoliła na rozdzielanie substancji niepolarnych lub chiralnych a nawet mikroorganizmów. Pionierskie prace w tym kierunku podjęte zostały przez Oshima i Kondo [81]. Armstrong z zespołem jako pierwsi uzyskali separację trzech różnych bakterii przy użyciu techniki ogniskowania izoelektrycznego (CIEF) [82,83]. Dokonano również [84] efektywnego rozdzielenia czterech szczepów bakterii (w ciągu 6.7 min !!!) za pomocą elektroforezy kapilarnej stosując do tego krótką kolumnę kwarcową (8.5 cm i średnicy 100 m), której ścianka modyfikowana była akryloamidem (rys. 15).

Naukowcy i praktycy szczególnie wiele uwagi poświęcili opracowaniu takich mikro-układów separacyjnych, które zapewniałyby wysoką sprawność, dobrą rozdzielczość i krótki czas oznaczenia. W literaturze pojawiły się moduły w postaci płytek szklanych, kwarcowych lub polimerowych z „wyżłobionymi” kanałami o głębokości 0.5 – 0.7 m (Rys.2) [4,6,85]. Powierzchnia takiego kanału, podobnie jak powierzchnia ziarna wypełnienia czy ściana kolumny kwarcowej, może być modyfikowana chemicznie.



Rys. 14 Test homogeniczności złoża monolitycznego. Kolumna metakrylanowa stosowana do mikro-HPLC i CEC (75μm x 250 mm) wraz ze zdjęciem z mikroskopu elektronowego. Rozdzielanie alkilobenzenów na długim i krótki odcinku kolumny chromatograficznej wraz z odpowiadającą im zależnością van Deemtera








A

B


C



Pseudomonas fluorescens

72 cm kapilara krzemionkowa

faza ruchoma: bufor TRIS pH=8.0, 10mM, U=20kV, detekcja λ = 210 nm



8.5 cm kapilara alkiloamidowa,
faza ruchoma: bufor TRIS pH=8.0, 10mmol dm-3, U=20kV, detekcja λ=210 nm

Rys. 15 Zastosowanie mikrokolumn. Schemat wieloetapowej modyfikacji ścianek kwarcowej kapilary kwarcowej (ang. fused silica) (A); Elektroforetyczne rozdzielanie bakterii z wykorzytsaniem kapilary kwarcowej (B), z wykorzystaniem kapilary alkiloamidowej (C) [84]
Przygotowana w ten sposób płytka wykazuje w zasadzie nieograniczone możliwości separacyjne dzięki wysokiej sprawności sięgającej nawet 1 000 000 półek teoretycznych przeliczanych na kolumny o długości 1 metra. Inną ważną zaletą jest znaczące skrócenie czasu analizy, np. dla białek, nawet do kilkudziesięciu sekund. W literaturze opisano zastosowanie chipów w takich technikach, jak: kapilarna elektroforeza strefowa (CZE) [86,87], kapilarna elektroforeza żelowa (CGE) [88], kapilarne ogniskowanie izoelektryczne (CIF) [89], micelarna chromatografia elektrokinetyczna (MEKC) [90], kapilarna elektrochromatografia (CEC) [91,92] i chromatografia cieczowa [93,94]. Układy te z powodzeniem wykorzystane zostały do separacji aminokwasów i białek, a duże nadzieje wiąże się z wykorzystaniem ich przy rozszyfrowaniu ludzkiego kodu genetycznego (genomika i proteomika)

Ogólnie ujmując zaletami stosowania mikroukładów są:



  • duża redukcja zużycia odczynników chemicznych,

  • wysoka sprawność dzięki zastosowaniu przepływu elektroosmotycznego i długich kolumn,

  • wysoka czułość masowa ze względu na małe rozcieńczenie,

  • możliwość łączenia ze spektrometrią np.; NMR, ICP i/lub MSn

  • unifikacja (ta sama kolumna zastosowana w różnych technikach np.: HPLC, SFC, CEC).



1   2   3   4


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna