Metody elektroforetyczne. Elektroforeza białek surowicy krwi w żelu agarozowym



Pobieranie 9.93 Kb.
Data09.05.2016
Rozmiar9.93 Kb.
Ćwiczenie 10. Metody elektroforetyczne. Elektroforeza białek surowicy krwi w żelu agarozowym.
Zasada:

Elektroforeza białek polega na ich rozdziale na różnego typu podłożach w polu elektrycznym. Rozdział elektroforetyczny białek surowicy na żelu agarozowym pozwala na uzyskanie sześciu frakcji białek surowicy: albuminy, -globuliny, 2-globuliny, 1-globuliny, 2-globuliny, -globuliny. Każda z frakcji zawiera liczne białka indywidualne.



Materiały i sprzęt:

Zasilacz, aplikator próbek, komora do elektroforezy, pojemniki, zbiorniki do inkubacji, uchwyty do żeli, suszarka, cylindry miarowe, kolby miarowe, pipety automatyczne, bibuła cienka, ramka do przenoszenia płytek



Odczynniki – zestaw HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 (Sebia):

  • żel agarozowy

  • bufor Tris-barbitalowy (pH 8,5)

  • rozcieńczalnik barwnika

  • barwnik – czerń amidowa

  • roztwór odbarwiający

Wykonanie:

UWAGA! W czasie oznaczeń używać rękawiczek jednorazowych – oznaczenia są wykonywane na potencjalnie zakaźnym materiale biologicznym!

  1. Przygotowanie próbek

  • próbki surowicy po rozmrożeniu powinny być dokładnie wymieszane

  1. Migracja

  • do każdej z części komory do elektroforezy nalać po 150 mL buforu Tris-barbitalowego

  • ustawić urządzenie aplikujące na płaskiej powierzchni, a nastepnie podnieść ramię z nadrukowanymi liczbami

  • na powierzchnię z nadrukowaną ramką nanieść 120 L wody destylowanej (w centralnej części na ok. 1/3 wysokości)

  • rozpakować żel

  • oprzeć płytkę z żelem (żelem do góry) o wystający brzeg na powierzchni urządzenia aplikującego

  • ugiąć delikatnie żel do góry i powoli ułożyć go w miejscu zaznaczonym przez ramkę (nie wolno dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza)

  • osuszyć powierzchnię żelu przez szybkie położenie bibuły (wilgotną bibułę natychmiast zdjąć)

  • ramię aplikatora opuścić na dół w pozycję środkową i oprzeć o podpórkę wychyloną ku górze

  • ułożyć aplikator jednorazowego użytku na płaskiej powierzchni (napisami do góry)

  • nałożyć po 10 L surowicy do każdego otworu w aplikatorze (7) (próbki nałożyć w ciągu 2 minut)

  • odłamać ramkę zabezpieczającą zęby aplikatora (ostrożnie aby nie prysnęła zawartość dołków)

  • aplikator z próbkami włożyć w ramkę w pozycji nr 5 (aplikator musi być zwrócony cyframi do analityka)

  • opuścić ramkę aplikatora tak aby dotknął powierzchni żelu (nie używać siły przy opuszczaniu ramki)

  • po upływie 40 sekund zmienić pozycję pokrętła ku górze i usunąć aplikator

  • w pobliżu prawej krawędzi żelu na wysokości badanych próbek nałożyć za pomocą pipetki z kroplę dowolnej surowicy zabarwionej błękitem bromofenolowym

  • zdjąć płytkę z agarozą i umieścić ją w komorze elektroforetycznej tak, aby żel był skierowany do spodu, a miejsca nałożenia próbek znajdowały się po stronie katodowej (-) (żel powinien być zanurzony w buforze na ok. 1 cm po każdej stronie)

  • włączyć zasilanie (90V, 12±3 mA)

  • czas migracji 20 minut (±2 minuty) – obserwować położenie barwnika

  • po migracji wyłączyć zasilanie i wyjąć płytkę z żelem – umieścić ją na szklanej płytce i suszyć w temp. 80°C do całkowitego wyschnięcia (ok. 10 minut)

  1. Barwienie i odbarwianie

  • po wysuszeniu żel umieścić w ramce (ramka do przenoszenia płytek)

  • wlać odczynnik barwiący i odbarwiający do oddzielnych pojemników plastikowych

  • zanurzyć ramkę z żelem do roztworu barwiącego na 4 minuty

  • przenieść ramkę z żelem do roztworu odbarwiającego i delikatnie poruszając odbarwić tło, aż stanie się całkiem przejrzyste (jeżeli tło nie stanie się przejrzyste należy zmienić odbarwiacz na świeży)

  • suszyć żel w temp. 80°C do całkowitego wyschnięcia (ok. 10 minut)

UWAGA! Bufor z komory do elektroforezy zlać do specjalnego pojemnika na odpady toksyczne!

Sprawozdanie powinno zawierać:

  • rysunek żelu z zaznaczonymi frakcjami białkowymi





©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna