Mikrobiologia ćwiczenia 2 I 3 Sterylizacja



Pobieranie 25.13 Kb.
Data09.05.2016
Rozmiar25.13 Kb.
MIKROBIOLOGIA

ĆWICZENIA 2 i 3
Sterylizacja.

Od kiedy większość eksperymentów przeprowadzana jest na czystych kulturach mikroorganizmów, tzn. na pojedynczych, określonych gatunkach, koniecznością stała się możliwość skutecznej sterylizacji/wyjaławiania (pozbawienia żywych organizmów oraz ich form przetrwalnych) różnych materiałów, m.in. podłoży hodowlanych, końcówek do pipet, butelek oraz innych naczyń i przyrządów służących do przechowywania czy posiewu mikroorganizmów i utrzymywanie ich w takim stanie przez dłuższy czas. Jeśli taki wyjałowiony materiał zostanie zanieczyszczony innymi mikroorganizmami, nie dodanymi tam celowo, to mówi się wówczas o zakażeniu. Sterylizację można przeprowadzić różnymi metodami, dostosowanymi do właściwości sterylizowanego materiału.



  • Sterylizacja parowa – najczęściej używanym urządzeniem do sterylizacji jest autoklaw. Służy on do sterylizacji podłoży, plastików laboratoryjnych, i innych materiałów wrażliwych na wysokie temperatury. Dzięki zastosowaniu autoklawu, czyli pojemnika umożliwiającego ogrzewanie pod zwiększonym ciśnieniem można osiągnąć temperatury powyżej punktu wrzenia wody pod ciśnieniem atmosferycznym. Aktualna temperatura pary wytwarzanej z wody w autoklawie zależy od ciśnienia, ale temperatura przy danym ciśnieniu jest znacznie niższa, jeśli w komorze znajduje się powietrze. Ponieważ efektywność sterylizacji zależy od temperatury, a nie od ciśnienia, należy zapewnić usunięcie powietrza ze sterylizatora za pomocą zaworu.

  • Sterylizacja sucha – stosowane do sterylizacji szkła i innych materiałów odpornych na wysokie temperatury oraz materiałów nieodpornych na wilgoć.

  • Filtrowanie – metoda stosowana do sterylizacji płynnych roztworów substancji termowrażliwych, np. antybiotyki czy witaminy oraz do sterylizacji powietrza przepływającego przez komory laminarne. Do sterylizacji płynów najczęściej wykorzystywany jest sterylny filtr nastrzykawkowy o średnicy porów 0,2 – 0,45 µm.

  • Naświetlanie – najczęściej stosowane w laboratoriach jest promieniowanie UV o długości fal ok. 260 nm. Służy do częściowej sterylizacji pomieszczeń, komór laminarnych.


Podłoża mikrobiologiczne.

Podłoże mikrobiologiczne jest to sztucznie stworzone środowisko do hodowli drobnoustrojów zawierające, w postaci przyswajalnych związków, wszystkie pierwiastki uczestniczących w tworzeniu masy komórkowej. Mikroorganizmy do wzrostu wymagają źródła energii, węgla, soli mineralnych i czasem tzw. czynników wzrostowych. Czynniki wzrostowe to substancje odżywcze, takie jak witaminy, aminokwasy czy zasady purynowe i pirymidynowe. Substancje te wchodzą w skład komórek, ale nie wszystkie komórki mogą je syntetyzować. Organizmy wymagające do wzrostu takich dodatkowych czynników nazywają się auksotrofami, w odróżnieniu do prototrofów, które nie są uzależnione od dodatkowych substancji odżywczych. Ze względu na skład, podłoża dzielimy na minimalne, pełne i wzbogacone. Podłoża minimalne zawierają tylko źródło energii, węgla i sole mineralne oraz czasem pojedyncze czynniki wzrostowe. Podłoża pełne zawierają wszystkie substancje niezbędne do dobrego wzrostu drobnoustrojów (źródło węgla, azotu, sole mineralne, wiele czynników wzrostowych). Podłoża wzbogacone stosuje się do hodowli drobnoustrojów słabo rosnących in vitro, wymagających dodatkowych substancji odżywczych. Jako czynniki wzbogacające podłoża stosuje się: krew, surowicę, płyny wysiękowe, wyciąg wątrobowy, mleko, żółtko jaj, sok z pomidorów.

Ze względu na konsystencje podłoża dzielimy na płynne, półpłynne i stałe. Pierwsze kultury bakteryjne prowadzone były na pożywce płynnej - bulionie odżywczym (wyciąg z tkanek zwierzęcych). Robert Koch wykorzystał plaster ziemniaka, kiedy uświadomił sobie potrzebę pożywek stałych. Jednakże nie wszystkie mikroorganizmy rosną na ziemniaku. Kolejną próbą było dodanie żelatyny do pożywki płynnej, jednakże żelatyna ulega upłynnieniu w warunkach standardowej inkubacji. Wtedy zastosowano agar jako czynnik zespalający pożywki mikrobiologiczne, który obecnie jest najbardziej uniwersalnym czynnikiem. Agar jest nie rozkładany przez większość bakterii. Otrzymuje się go z morskich krasnorostów, u których występuje w ścianach komórkowych. Agar rozpuszcza się w temperaturze 100oC, krzepnie przy temperaturze 45oC (stężenie 2% w pH obojętnym). Agar zestalony może być inkubowany w temperaturach do 100oC i pozostaje w konsystencji stałej.

Podłoża ze względu na przeznaczenie i zastosowanie dzielimy na namnażające, wybiórcze (zawierają dodatek substancji chemicznych hamujących wzrost konkretnej grupy drobnoustrojów), namnażająco -wybiórcze (pozwala na namnożenie jednego typu organizmu, a hamuje wzrost innych), oraz pożywki izolacyjne (podłoże stałe zawierające odpowiedni wskaźnik pozwalający odróżnić od siebie kolonie bakterii).

Podłoża do hodowli mogą być przygotowane w różnej formie. Hodowle płynne w zależności od ilości podłoża prowadzi się w probówkach, kolbach, butlach lub fermentatorach. Hodowle na podłożu stałym wykonujemy na szalkach Petriego, słupach, lub skosach.
Przykładowe pożywki drożdżowe:

Podłoże minimalne płynne:

Zestaw soli mineralnych (nitrogen base) 6,7 g

Glukoza 20 g

Woda destylowana 1000 ml


Podłoże pełne stałe:

Bacto-Ekstrakt drożdżowy 10 g

Bacto-Pepton 20 g

Glukoza 20 g

Agar 20 g

Woda destylowana 1000 ml


Przechowywanie mikroorganizmów

Mikroorganizmy przechowywane w różnych warunkach różnią się znacznie od siebie czasem przeżywania okresu przechowywania. W celu krótkoterminowego – kilka dni do ok. dwóch tygodni - przechowywania drobnoustrojów wystarczy je włożyć do chłodziarki w formie takiej jakiej są – w podłożu płynnym lub posiane na szalce agarowej. Chcąc je przechować dłużej należy je zamrozić. Aby zamarzająca woda nie zniszczyła komórek drobnoustrojów, zamraża się je w 15% roztworze glicerolu. W temperaturze –20 C mikroorganizmy mogą być przechowywane kilka miesięcy a w temperaturze –70 C mogą być przechowywane praktycznie bezterminowo.


Cykl życiowy drożdży

Drożdże Saccharomyces cerevisiae są bardzo dobrym eukariotycznym organizmem modelowym dzięki posiadaniu małego genomu, małej liczbie chromosomów oraz krótkiego czasu podwojenia. Są łatwe w hodowli, szybko rosną, są łatwe do manipulacji genetycznych. Nie formują grzybni, rozmnażają się tylko przez pączkowanie. Ogromną zaletą drożdży jest możliwość utrzymywania ich zarówno jako szczepy diploloidalne jak i haploidalne. Istnienie stabilnej fazy haploidalnej jest wyjątkowo atrakcyjne dla genetyków ze względu na możliwość izolacji i identyfikacji szczepów niosących recesywne mutacje. Naturalnie występujące szczepy drożdży są diploidalne i mają funkcjonalny allel genu HO, powodujący spontaniczną zmianę typu kojarzeniowego co każdy podział. Szczepy laboratoryjne mają zmutowany gen ho i dzięki temu mogą być utrzymywane jako szczepy o niezmiennym typie kojarzeniowym. Haploidy mogą występować jako dwa typy kojarzeniowe, typ kojarzeniowy a- lub α-, różniące się od siebie tylko w jednym locus, zwanym locus MAT. Dwa allele tego locus to MATa i MATα. Stabilne szczepy a- lub α- dzielą się mitotycznie produkując identyczne klony komórek. Szczep MATa kojarzy się ze szczepem MATα poprzez kompleksowy proces cytoplazmatycznej i jądrowej fuzji dzięki czemu powstaje komórka diploidalna. Taka komórka jest również stabilna i dzieląc się mitotycznie produkuje identyczny genetycznie klon. Istnienie stabilnego diploida jest również bardzo korzystne dla genetyków. Pozwala na określenie recesywności lub dominacji nowej mutacji lub na przeprowadzenie testu komplementacji (czy szczepy niosące po jednej mutacji niosą allele tego samego genu czy są to mutacje w różnych genach).


Gdy drożdże są wystawione na działanie niekorzystnych warunków pokarmowych, komórki diploidalne przechodzą mejozę produkując cztery komórki potomne, zwane askosporami: dwie typu kojarzeniowego a- i dwie typu kojarzeniowego α-. Askospory tworzą tetradę, która jest zawarta w pojedynczej strukturze zwanej ascus (worek). Gdy przywróci się odpowiednie warunki pokarmowe, każda z tych czterech askospor wykiełkuje i zacznie się rozmnażać jako komórki haploidu.



Zadanie nr 1: Kojarzenie drożdży


Celem doświadczenia jest skojarzenie dwóch haploidalnych szczepów drożdży i otrzymanie szczepu diploidalnego, zdolnego do wzrostu na podłożu minimalnym. Szczepy haploidalne użyte w tym doświadczeniu są auksotrofami różnych aminokwasów i nie są w stanie rosnąć na podłożu minimalnym. Dopiero po skojarzeniu powstaje heterozygotyczny diploid zdolny do syntezy wszystkich aminokwasów. Należy skojarzyć szczepy każdy z każdym.
Materiały:

- probówki z trzema płynnymi kulturami haploidalnych drożdży

- pipeta i sterylne końcówki do pipety

- szalki Petriego ze stałym podłożem minimalnym


Przebieg doświadczenia:

Praca w grupach pod komorami laminarnymi.

1. Połóż szalkę minimalną na części z agarem i ją otwórz zdejmując pokrywkę.

2. Wstrząśnij płynną kulturę haploida nr1 na worteksie.

3. Nastaw pipetę na 10 l.

4. Otwórz naczynie ze sterylnymi końcówkami do pipet i delikatnie nabij jeden na pipetę dbając, by podczas wyciągania nie dotknąć niczego jej sterylnym końcem.

5. Włóż delikatnie pipetę do probówki i przenieś kroplę zawiesiny drożdży na szalkę umieszczając ją po lewej stronie szalki.

6. Dbając, by niczego po drodze nie dotknąć, przenieś drugą kroplę zawiesiny drożdży i umieść ją na środku szalki.

7. Wstrząśnij płynną kulturę haploida nr2 na worteksie.

8. Zmień końcówkę pipety i przenieś kroplę zawiesiny na prawą stronę szalki.

9. Zmień końcówkę pipety, przenieś kroplę zawiesiny i umieść ją na kropli będącej już na środku szalki.

10. Poczekaj, aż krople wyschną.

11. Powtórz to wszystko dla drugiego (nr1 i nr3) i trzeciego (nr2 i nr3) kojarzenia i przełóż szalkę do inkubatora.

Kontynuacja doświadczenia tydzień później.

12. Wyjmij szalki z inkubatora i oceń wzrost poszczególnych szczepów.




Zadanie nr 2: Test replik


Na otrzymanych szalkach z podłożem pełnym YPD (yeast peptone dextrose) wysiano prototroficzny pod względem syntezy leucyny szczep drożdży. Istnieje jednak podejrzenie, że nastąpiło zakażenie kultury wyjściowej innym, auksotroficznym pod tym samym względem szczepem drożdży. W celu sprawdzenie, które kolonie wyrosłe na szalce z podłożem pełnym są auksotroficzne, należy wykonać test replik na podłożu nie zawierającym leucyny. Założeniem tej metody jest odbicie drożdży z powierzchni agaru na sterylny welwet, a następnie transfer tego „wzoru” na kolejną szalkę. Doświadczenie ma na celu oszacowanie proporcji kolonii drożdży auksotroficznych pod względem syntezy leucyny do kolonii prototroficznych, wyrosłych na tej samej szalce za pomocą testu replik.
Materiały:

- szalki z wyrośniętymi koloniami drożdży na podłożu YPD

- sterylne szmatki welwetowe

- szalki Petriego ze stałym podłożem SC-leu


Procedura:

Praca w grupach pod komorami laminarnymi.

1. Wyjmij z naczynia sterylny welwet i ostrożnie rozprostuj go uważając, by nie dotknąć palcami powierzchni z włoskami w centrum szmatki.

2. Rozprostowaną szmatkę połóż na stemplu włoskami do góry i przymocuj do niego gumką recepturką.

3. Szalkę matrycę otwórz, delikatnie przyciśnij agarem do welwetu i zamknij.

4. Szalkę docelową otwórz, delikatnie przyciśnij do welwetu, zamknij i umieść w inkubatorze.



Kontynuacja doświadczenia tydzień później.

5. Wyjmij szalki z inkubatora i określ proporcję kolonii nie rosnących na podłożu testowym.



Zadanie nr 3: Obserwacja komórek wegetatywnych i zesporulowanych drożdży pod mikrospkopem.



Materiały:

- płynne kultury drożdży wegetatywnych i zesporulowanych

- sterylne patyczki drewniane

- szkiełka mikroskopowe i nakrywkowe


Procedura:

Na szkiełko podstawowe należy nanieść pipetą kroplę kultury drożdży i nakryć szkiełkiem nakrywkowym. Narysuj komórki wegetatywne i spory.




Zadanie nr 4: Oznaczanie genotypu drożdży wegetatywnych na podłożach selekcyjnych


Doświadczenie ma na celu określenie genotypów pięciu szczepów drożdży na podstawie ich zdolności do wzrostu lub jej braku na różnych podłożach. Podłoża, na których będą przeprowadzane testy to podłoża syntetyczne pełne SCminus , czyli w pełni zdefiniowane o dokładnie poznanym składzie, w których brakuje pojedynczego czynnika wzrostowego, w tym wypadku są to poszczególne aminokwasy. Na takim podłożu mogą rosnąć tylko te drożdże, które mają sprawny szlak syntezy danego aminokwasu. Gdy szlak ten jest uszkodzony na jakimś etapie, drożdże na takim podłożu nie rosną i nazywane są aksotrofami tego poszczególnego nutrientu, np. szczep nie rosnący na podłożu SC-ura to auksotrof uracylu.
Materiały:

- szalki z wyrośniętymi koloniami drożdży o nieznanym genotypie na podłożu pełnym bulionowym YPD

- szalki z wykonanymi replikami na podłożach SC-lys, SC-ade, SC-ura, SC-leu, SC-his
Procedura:

Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych określ genotypy poszczególnych szczepów drożdży.


Zadanie nr 5: Oznaczanie genotypu askospor na podłożach selekcyjnych


Używając mikromanipulatora można rozdzielić askospory pochodzące z jednej tetrady. Uzyskuje się w ten sposób genetycznie identyczne haploidalne klony będące produktem mejozy jednej komórki diploidalnej. W ten sposób można otrzymać szczepy o nowym pożądanym genotypie. Doświadczenie ma na celu określenie genotypów askospor powstałych w wyniku sporulacji diploidalnego szczepu drożdży oraz określenie, czy askospory rzeczywiście pochodzą z jednej tetrady.
Materiały:

- szalka z wyrośniętymi koloniami powstałymi w wyniku rozłożenia za pomocą mikromanipulatora nadtrawionych tetrad na pełnym bulionowym podłożu YPD



- szalki z wykonanymi replikami na podłożach SC-lys, SC-ade, YPD+nat
Procedura:

Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych określ genotypy poszczególnych kolonii wyrosłych z pojedynczych askospor i określ na tej podstawie czy dana tetrada jest tetradą prawdziwą czy fałszywą.


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna