Paciorkowce – izolacja i różnicowanie



Pobieranie 105.33 Kb.
Data08.05.2016
Rozmiar105.33 Kb.
Paciorkowce – izolacja i różnicowanie




W tabeli przedstawiono uproszczoną klasyfikację paciorkowców i ich rolę w zakażeniach

Typ hemolizy>

Podstawowi przedstawiciele

Chorobotwórczość

β-hemoliza
(całkowita hemoliza
krwinek czerwonych

Streptococcus pyogenes (gr A)

paciorkowcowe zapalenie gardła
(powikłania: gorączka reumatyczna, glomerulonephritis),
impetigo - zakażenia skóry

 

Streptococcus grupy BStr.agalactiae)

zakażenia noworodków
zakażenia położnic

 

Streptococcus gr C

zakażenia ropne
także zapalenie gardła

 

Streptococcus gr G, F

prawdopodobnie zakażenie gardła

α-hemolizujące
(niepełna hemoliza -
zazielenienie płytki z krwią)

Streptococcus pneumoniae

zapalenie ucha środkowego,
zatok obocznych nosa,
zapalenie płuc,
opon mózgowo-rdzeniowych, posocznica

y-hemolizujące
(brak hemolizy)

Str.viridans
(paciorkowce zieleniące)
Str.mutans

endocarditis,
posocznica u chorych z neutropenią,
próchnica zębów,
inne zakażenia stomatologiczne

różnie

beztlenowe i mikroaerofilne
paciorkowce -
Peptostreptococcus

ropnie narządowe:
mózgu
wątroby

 

paciorkowce grupy D:
Enterococcus:
E.faecalis
E.faecium
E.durans

endocarditis,
zakażenia układu moczowego
zakażenia ran pooperacyjnych,
zakażenia związane z liniami naczyniowymi

 

Nie Enterococcus:
Str.bovisStr.
equinus

endocarditis
bakteriemia

CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA PACIORKOWCA ROPNEGO (S.pyogenes)

Jest to ziarenkowiec Gram(+) zaklasyfikowany do grupy A na podstawie obecności swoistego wielocukru w ścianie komórkowej. Węglowodany ściany komórkowej paciorkowców zostały po raz pierwszy scharakteryzowane w roku 1930 przez panią Rebekę Lancefield i podział ten jest aktualny do dzisiaj. W obrębie paciorkowców grupy A swoiste białka ściany komórkowej typu M, T, R pozwalają na zróżnicowanie 80 różnych serotypów tego drobnoustroju. Warto pamiętać, że grupowe wielocukry ściany komórkowej paciorkowców nie są czynnikami zjadliwości tych bakterii.

Białko M swoiste dla określonego typu, oporne na temperaturę, a wrażliwe na trypsynę jest podstawowym składnikiem fimbrii - wypustek protoplazmatycznych. Wykazano, że białko to charakteryzuje się pokrewieństwem antygenowym z sarkolemmą mięśnia sercowego i jest odpowiedzialne za nadwrażliwość typu późnego w testach skórnych.

Białko typu T jest antygenem opornym na trypsynę, występuje w kilku odmianach antygenowych, jest obecne również w szczepach należących do innych grup serologicznych np. C i G. Białko T jest podstawą typowania paciorkowców do celów epidemiologicznych.


Wykazano, że białko T i R może także tworzyć składowe fimbrii.

Ściana komórkowa odpowiedzialna za kształt komórki ma budowę kompleksową, składa się z peptydoglikanu, węglowodanów oraz kwasów lipotejchowych (LTA) oraz wcześniej tego Drobnoustroje mają kształt okrągły, układają się w postaci krótkich lub dłuższych łańcuszków, barwią się na kolor fioletowy w metodzie Grama (Gram+). Do wzrostu wymagają bogatych składników odżywczych np. odwłóknionej krwi lub surowicy. Optymalna temperatura wzrostu wynosi 37°C mogą rosnąć w warunkach beztlenowych. Na podłożach stałych z dodatkiem krwi powodują całkowite rozpuszczenie krwinek manifestujące się odbarwieniem podłoża (hemoliza). Czasem tworzą kolonie śluzowe, co uwarunkowane jest obecnością otoczki z kwasu hialuronowego. Większość szczepów ma na stałe zintegrowanego w genom bakteriofaga łagodnego, który służy jako wektor informacji genetycznej np. tylko szczepy lizogenne są zdolne wytwarzać toksynę pyrogenną (Spe). Niektóre szczepy paciorkowca ropnego opornego na antybiotyki makrolidowe są nośnikami pozachromosomalnego materiału genetycznego w postaci plazmidu R.

Wszystkie szczepy paciorkowców grupy A są wysoce wrażliwe na penicylinę. MIC penicyliny dla większości z nich wynosi 0,016 µg/ml; lub mniej. Wszystkie paciorkowce grupy A są wrażliwe na bacytracynę i właściwość tę wykorzystano do ich szybkiej identyfikacji i odróżnienia od innych grup w warunkach in vitro.

Pierwszym etapem zakażenia jest kolonizacja błon śluzowych górnych dróg oddechowych. Wiadomo jednak, że śluzówki gardła są chronione przed kolonizacją przez stałe spłukiwanie ich powierzchni śliną. Zatem bakterie kolonizujące śluzówki muszą mieć właściwości przylegania do komórek śluzówkowych. Przez wiele lat przypuszczano, że głównymi adhezynami paciorkowców ropnych są fimbrie tworzące białko M oraz kwasy tejchowe. Okazało się jednak, że główną adhezyną paciorkowca jest powierzchniowe białko F odpowiedzialne za przyleganie bakterii do komórek śluzówki gardła. Białko F ma zdolność wiązania fibronektyny komórek nabłonkowych.


Prawdopodobnie białko M odpowiedzialne jest za wiązanie paciorkowca ropnego z keratocytami skóry. Jednym z późnych powikłań anginy paciorkowcowej jest reumatyczne zapalenie stawów.
Wykazano, że szczepy powodujące to powikłanie posiadają grubą otoczkę z kwasu hialuronowego, która powoduje, że na podłożach stałych kolonie paciorkowca mają wygląd śluzowy.

Warto pamiętać, że kwas hialuronowy jest składnikiem tkanek człowieka i nie posiada właściwości immunogennych, w odróżnieniu od bakteryjnego, który stymuluje układ odpornościowy do syntezy swoistych przeciwciał. Otoczki z kwasu hialuronowego podobnie jak wszystkie inne otoczki bakteryjne mają właściwości antyfagocytarne. Chronią bakterie rosnące na powierzchni śluzówek przed zabiciem przez fagocyt. Otoczki opóźniają także proces rozpoznania bakterii przez układ odpornościowy człowieka, jednak nie chronią przed nim całkowicie, bowiem wiadomo, że nieleczona angina paciorkowcowa ulega samowyleczeniu. Właściwości antyfagocytarne ma także białko M. Warto jednak pamiętać, że gorączkę reumatyczną mogą powodować także szczepy nie posiadające otoczki z kwasu hialuronowego. Główne objawy paciorkowcowego zapalenia gardła jak obrzęk, ból oraz tworzenie ropni wiąże się ze zdolnością paciorkowca do powodowania odczynu zapalnego. Dwa typy produktów wytwarzanych przez paciorkowce mogą powodować odpowiedź zapalną. Jednym z nich są enzymy hydrolityczne jak hemolizyny, proteazy, DNA-zy, streptokinaza oraz streptolizyny (O, S).

Streptolizyna O jest toksyną, której budowa chemiczna oraz mechanizm działania przypomina pneumolizynę dwoinki zapalenia płuc. Streptolizyna działa bezpośrednio toksycznie na erytrocyty powodując tworzenie otworów w błonie protoplazmatycznej i lizę komórki. Streptolizyna uszkadza także szereg innych komórek np. komórek tkanki sercowej. Toksyna ta ma silne właściwości immunogenne, co sprawia, że osoby chore mają wyraźnie podwyższony

Niektóre lizogenne szczepy Str.pyogenes wytwarzają toksynę pyrogenną (erytrogenną) Spe o zróżnicowanej budowie antygenowej (typ A, B, C) odpowiedzialną za wysypkę w szkarlatynie. Okazało się, że egzotoksynę podobną do Spe typu A wytwarzają także szczepy S.pyogenes powodujące inwazyjne zakażenie u osób skądinąd zdrowych, które charakteryzuje się wstrząsem, niewydolnością wielonarządową i jest obarczone wysoką śmiertelnością. Mechanizm działania toksyny pyrogennej typu A (TSLS - toxic shock like syndrome) jest podobny do mechanizmu działania toksyny wstrząsu toksycznego TSST-1 wytwarzanej przez niektóre szczepy gronkowca. Sugeruje się, że szczepy S.pyogenes wytwarzające Spe A są odpowiedzialne za niezwykłą zjadliwość szczepów TSLS. Wykazano także, że reumatogenne szczepy Str.pyogenes odpowiedzialne za anginę wytwarzają również Spe - o właściwościach superantygenu odpowiedzialnego za późne powikłanie jakim jest gorączka reumatyczna.

Wszystkie istniejące teorie próbujące wyjaśnić mechanizm gorączki reumatycznej są niedoskonałe i nie potrafię odpowiedzieć na pytanie dlaczego nawet późne podanie antybiotyku, tj. do 9 dni od zakażenia zapobiega powikłaniu i dlaczego gorączka reumatyczna charakteryzuje się tendencją do nawrotów, a nawrót zakażenia jest podobnie odległy w czasie jak w przypadku pierwszego epizodu. Tylko około 25% szczepów paciorkowca ropnego powodującego zapalenie gardła powoduje późne powikłania w postaci gorączki reumatycznej. Powikłanie to pojawia się po kilku tygodniach od przebycia zakażenia.

Drugim typem substancji odpowiedzialnych za proces zapalny są elementy strukturalne komórki jak peptydoglikan oraz kwasy tejchojowe aktywujące dopełniacz oraz wyzwalające syntezę cytokin prozapalnych (IL-1, TNF). Zróżnicowana zjadliwość szczepów paciorkowca ropnego lub odporność gospodarza na zakażenie tłumaczy bezobjawowe nosicielstwo tego drobnoustroju bez jakichkolwiek późnych powikłań.

Szczepy paciorkowca ropnego izolowane od chorych z nosicielstwa wykazują odmienną budowę białka M, co może tłumaczyć ich ucieczkę przed układem odpornościowym gospodarza.

DIAGNOSTYKA PACIORKOWCÓW


Klasyczna diagnostyka paciorkowcowego zapalenia gardła polega na:

Standardowym badaniem jest posiew wymazu pobranego z tylnej ściany gardła i powierzchni migdałków na odpowiednie podłoża bakteriologiczne. Podstawowym podłożem do hodowli paciorkowców ropnych jest agar krwawy umożliwiający określenie typu hemolizy (patrz tabela), której występowanie warunkuje streptolizyna O. Najprostszym testem pozwalającym zróżnicować paciorkowce grupy A od innych grup serologicznych jest wrażliwość na bacytracynę. Około 95% szczepów paciorkowca ropnego jest wrażliwych na bacytracynę, podczas gdy 99% opornych na bacytracynę β-hemolizujących paciorkowców należy do innych grup. Warto pamiętać, że tylko paciorkowce grupy A są odpowiedzialne za późne powikłania typu gorączki reumatycznej. Czułość hodowli wynosi 90%, co wskazuje, że ujemny wynik całkowicie nie wyklucza możliwości anginy paciorkowcowej.

Pneumokoki – S. pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc)

Jest etiologicznym czynnikiem płatowego zapalenia płuc i najczęstszą przyczyną bakteryjnego zapalenia płuc u człowieka. Czynnikiem zjadliwości jest gruba otoczka polisacharydowa wykazująca silne działanie antyfagocytarne.. Wytwarza agresyny i inwazyny: pneumolizyny i leukocydyny.

Cechy hodowlane i różnicowanie

Paciorkowce mają duże wymagania wzrostowe. Są względnymi beztlenowcami. Izoluje się je na podłożach zawierających wyciąg sercowo-mózgowy, dodatkowo wzbogacony krwią lub surowicą.

Pożywki wybiórcze pozwalające na izolowanie paciorkowców z materiału klinicznego zawierają 0,02% azydku sodowego, który hamuje wzrost gramujemnej flory towarzyszącej. Na pożywkach stałych z krwią tworzą otoczone strefą hemolizy kolonie.
Ważniejsze testy wykonywane w różnicowaniu paciorkowców
Identyfikacja serologiczna grup paciorkowców

Wykorzystuje się czynny wielocukier C, który izoluje się z komórek wyizolowanych szczepów na drodze ekstrakcji enzymatycznej lub chemicznej (zestawy farmaceutyczne) – precypitacja z surowicami A,C,G



Test wrażliwości na bacytracynę (test krążkowy)

Test ten różnicuje paciorkowce β-hemolizujące. Szczególna wrażliwość na nawet bardzo małe jej stężenia wykazują paciorkowce grupy A (S.pyogenes). Zahamowanie wzrostu wokół krążków > lub = 15 mm uważa się za wynik dodatni – szczep wrażliwy. Jeżeli strefa jest < to przynależność do gatunku potwierdzić innymi testami.


Wrażliwość na kotrimoksazol (SXT) (sulfometaksazol+trimetoprim) –służy do różnicowania paciorkowców β-hemolizujących. Paciorkowce grupy A i B są oporne, grupy C są wrażliwe.
Test wrażliwości na optochinę

W sposób wybiórczy hamuje wzrost Streptococcus pneumoniae, co odróżnia te dwoinki od innych paciorkowców – α hemolizujących wrażliwych na znacznie większe stężenia tego związku. Zahamowanie wzrostu wokół krążka uważa się za wynik dodatni.


Rozpuszczalność w żółci

Próba jest pomocna w identyfikacji S.pneumoniae. Sole żółci uaktywniają autolizyny, co prowadzi do rozpuszczenia komórek -widoczne gołym okiem. Na kolonie nakroplić 2% deoksycholan sodu, inkubować 30 min w 37○C.




Wykrywanie hydrolizy eskuliny

Eskulina fluoryzuje w świetle UV o długości fali 360 nm. Hydroliza związku prowadzi do zaniku fluorescencji. Powstająca z eskuliny eskuletyna daje czarne zabarwienie z jonami żelazowymi. Stosuje się pożywki z 0.1% eskuliną i cytrynianem żelazowym. Inkubacja w 35 st.C. bakterie hydrolizujące eskulinę zaczerniają podłoże, utrata fluorescencji.


Wykrywanie zdolności do redukcji TTC chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolinowego – wzrost w postaci ciemnoczerwonych koloni – praktyczne zastosowanie do różnicowania Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium
Rozkład hipuranu sodu do glicyny, glicynę wykrywa się odczynnikiem ninhydrynowym – niebieski zabarwienie – reakcja dodatnia.
Test PYR – służy do różnicowania rodzajów Enterococcus i Streptococcus. Wykrywany jest w nim enzym L-pyrolidonyloaryloamidaza – wytwarzany tylko przez niektóre z nich. Odszczepiany jest β-naftylamid z substratu. Uwolniony związek z barwnikiem diazowym tworzy kompleks o barwie różowo-czerwonej.
Podstawowe reakcje do odróżniania paciorkowców kałowych od paciorkowców zieleniejących:

  1. paciorkowce kałowe - Enterokoki - dobrze rosną na zwykłych podłożach.

  2. badanie wzrostu w mleku zawierającym 0.1% błękit metylenowy

  3. wzrost w podłożu bulionowym o pH 9.6

  4. wzrost w temp.10 - 45 st. C

  5. zdolność wzrostu na podłożu z żółcią i eskuliną (rozkład eskuliny, wzrost na podłożu z 40% żółcią)

  6. hemoliza – zwykle nie hemolizują lub β-dla E.faecalis, α-dla E.faecium

  7. oporność na ogrzewanie w 60 st.C przez 30 min.

10.wzrost w obecności 6.5% NaCl

Zdolność do rozkładu arabinozy odróżnia E.faecalis od E.faecium

Testy API 20 Strep-Kit wykonane dla Streptococcus pyogenes, E.faecalis i E.faecium, Streptococcus pneumoniae;
bioMérieux® sa Polski - 1

REF 20 600 07625E - PL - 2003/01

®

20 Strep

System do identyfikacji Streptococcaceae i drobnoustrojów spokrewnionych



WPROWADZENIE

System API 20 Strep jest wystandaryzowanym zestawem

zawierającym 20 testów biochemicznych, który daje

szerokie możliwości. Umożliwia on identyfikację grup lub

gatunków większości paciorkowców i enterokoków oraz

najbardziej powszechnych spokrewnionych drobnoustrojów.

Pełna lista organizmów, które można

zidentyfikować przy użyciu tego systemu jest podana na

końcu niniejszej instrukcji w Tabeli Identyfikacyjnej.

ZASADA DZIAŁANIA

Pasek API 20 Strep składa się z 20 mikroprobówek

zawierających odwodnione substraty umożliwiające ocenę

aktywności enzymatycznej lub fermentacji cukrów.

Testy enzymatyczne posiewa się gęstą zawiesiną

drobnoustrojów, odtwarzającą substraty enzymatyczne,

przygotowaną z czystej hodowli. Procesy metaboliczne

zachodzące podczas inkubacji powodują zmiany koloru,

które są albo spontaniczne, lub wywołane przez dodanie

odczynników.

Testy fermentacyjne posiewa się podłożem

wzbogaconym, które uwadnia substraty cukrowe.

Fermentacja węglowodanów jest wykrywana dzięki

zmianom barwy wskaźników pH.

Po odczytaniu reakcji według Tabeli Odczytów, otrzymuje

się identyfikację przez porównanie z Książką Kodów lub

stosując program komputerowy.

ZAWARTOŚĆ ZESTAWU (Zestaw na 25 testów):

- 25 pasków API 20 Strep

- 25 komór inkubacyjnych

- 25 ampułek API GP Medium

- 25 kart wyników

- 25 wymazówek *

- 1 instrukcja

* Zastosowanie tych wymazówek jest ograniczone



wyłącznie do pobierania materiału z kolonii

bakteryjnych uzyskanych na podłożach hodowlanych.

Nie należy stosować ich do pobierania próbek

bezpośrednio od pacjentów.

SKŁAD

Pasek

Skład paska API 20 Strep podano w tej instrukcji w Tabeli

Odczytów.

Podłoże

API GP

Medium

2 ml


L-cystyna 0.5 g

Trypton (wołowy/wieprzowy) 20 g

Chlorek sodu 5 g

Siarczyn sodu 0.5 g

Czerwień fenolowa 0.17 g

Woda demineralizowana do 1000 ml

pH : 7.4 - 7.6

Wskazane stężenia mogą być regulowane w zależności od

miana użytego surowego materiału.

WYPOSAŻENIE WYMAGANE NIE NALEŻĄCE DO

ZESTAWU

Odczynniki:

- API Suspension Medium, 2 ml (Ref. 70 700)

- Odczynniki : NIN (Ref. 70 490)

VP 1 + VP 2 (Ref. 70 422)

ZYM A + ZYM B (Ref. 70 472)

- Olej mineralny (Ref. 70 100)

- Standard McFarlanda (Ref. 70 900) punkt 4 w/g skali

lub w DENSIMACIE (Ref. 99 234)

- Książka Kodów dla API 20 Strep (Ref. 20 690)

lub oprogramowanie komputerowe do identyfikacji

(skontaktuj się z bioMérieux))

- Płytki z agarem Columbia z krwią (Ref. 43 041)

- bulion Schaedlera (nie obowiązkowo)

Materiały:

- Pipety lub PSIpety

- Osłona na ampułkę

- Statyw do ampułek

- Pojemnik do hodowli beztlenowców

- Wyposażenie zazwyczaj stosowane w laboratorium

mikrobiologicznym

ŚRODKI OSTROŻNOŚCI

Do diagnostyki in vitro i kontroli mikrobiologicznej.

Do wykorzystania wyłącznie przez profesjonalistów.

Produkt zawiera materiały pochodzenia zwierzęcego.

Świadectwo pochodzenia i/lub stanu sanitarnego

zwierząt nie gwarantuje w pełni nieobecności czynników

chorobotwórczych. Dlatego należy obchodzić się z nim

zgodnie z zasadami postępowania z materiałem

potencjalnie zakaźnym (nie spożywać i nie wdychać).

Wszystkie próbki pobrane od pacjentów, hodowle

bakteryjne i wykorzystane produkty są potencjalnie

zakaźne i powinny być traktowane zgodnie z zalecanymi

środkami ostrożności. Należy stosować techniki

aseptyczne i zwykłe procedury obowiązujące przy pracy

ze szczepami bakteryjnymi zgodnie z "NCCLS M29-A,

Protection of Laboratory Workers from Instrument

Biohazards and Infectious Disease Transmitted by

Blood, Body Fluids, and Tissue; Approved Guideline -

December 1997". Dodatkowe środki ostrożności

zawarte są w "Biosafety in Microbiological and

Biomedical Laboratories, HHS Publication No. (CDC)

93-8395, 3rd Edition (May 1993)", lub regulowane

przepisami właściwymi dla poszczególnych państw.

Nie używać odczynników przeterminowanych.

Przed użyciem sprawdzić, czy opakowania

poszczególnych składników są nienaruszone.

Nie używać pasków uszkodzonych : odkształcone

studzienki, ...

IVD

api® 20 Strep 07625E - PL - 2003/01

bioMérieux® sa Polski - 2

Ampułki otwierać ostrożnie w następujący sposób:

- Umieścić ampułkę w osłonie.

- Trzymać osłoniętą ampułkę w jednej ręce

w pozycji pionowej (białą plastikową

nasadką do góry).

- Wcisnąć nasadkę do dołu tak daleko jak to

możliwe.


- Przykryć spłaszczoną końcówkę nasadki

górną częścią kciuka.

- Skierować nacisk kciuka od siebie na

spłaszczoną część nasadki tak, aby odłamać

końcówkę ampułki znajdującą się wewnątrz

nasadki.


- Wyjąć ampułkę z osłony, którą należy

odłożyć do kolejnego użycia

- Ostrożnie zdjąć nasadkę.

W celu osiągnięcia odpowiednich wyników należy

stosować procedurę zawartą w opakowaniu. Każda

modyfikacja procedury może wpływać na wyniki.

W interpretacji wyników testu należy wziąć pod uwagę

historię choroby pacjenta, miejsce pobrania materiału,

makro- i mikroskopową morfologię oraz jeśli będzie

konieczne, wyniki innych przeprowadzonych testów,

szczególnie lekowrażliwości.

PRZECHOWYWANIE

Paski i podłoża powinny być przechowywane

w temperaturze 2-8°C do końca daty ważności podanej

na opakowaniu.



MATERIAŁ DO BADAŃ (POBIERANIE

I OPRACOWANIE)

Paski API 20 Strep nie są przeznaczone do

bezpośrednich badań materiału klinicznego lub innych

próbek.


Identyfikowany mikroorganizm musi być najpierw

wyizolowany na podłożach hodowlanych zgodnie ze

standardowymi technikami mikrobiologicznymi.

SPOSÓB WYKONANIA

Wybór kolonii bakteryjnych

Po wyizolowaniu mikroorganizmu, który ma być

identyfikowany sprawdzić, czy należy on do rodziny

Streptococcaceae (barwienie metodą Grama, test na

katalazę):

Zanotować typ hemolizy na karcie wyników (21. test).

Pobrać dobrze wyizolowaną kolonię (Uwaga 1)

i zawiesić ją w 0.3 ml jałowej wody. Dobrze wymieszać.

Zalać tą zawiesiną płytkę z agarem Columbia z krwią

baranią (Uwaga 2) (lub rozprowadzić jałową

wymazówką po powierzchni agaru).

Inkubować płytkę przez 24 godziny (± 2 godziny)

w 36°C ± 2°C w warunkach beztlenowych.



UWAGA 1 : Paciorkowce ß-hemolizujące i enterokoki

wytwarzają wystarczająco duże kolonie po 24 godzinach

inkubacji. Dla innych paciorkowców zaleca się, aby

wybierać kolonie po 48 godzinach inkubacji. Dla

szczepów o wysokich wymaganiach odżywczych

(wytwarzających drobne kolonie po 48 godzinach), zaleca

się stosowanie następującej procedury:

- Nanieść kolonię do 1 ml bulionu Schaedlera i hodować

w 36°C ± 2°C przez 5 godzin.

- Zalać otrzymaną hodowlą płytkę z agarem Columbia

z krwią baranią. Usunąć nadmiar płynu.

- Inkubować płytkę przez 18-24 godzin w 36°C ± 2°C

w warunkach beztlenowych.

UWAGA 2: W przypadku podejrzenia występowania

pneumokoków, zaleca się przygotować 2 płytki agarowe,

aby otrzymać wystarczający wzrost.

Przygotowanie paska

Przygotować komorę inkubacyjną (podstawkę

i pokrywkę) i nanieść około 5 ml destylowanej lub

demineralizowanej wody [lub jakiejkolwiek wody bez

dodatków lub związków chemicznych, z których mogą

wydzielać się gazy (np. Cl2, CO2, itd.)] na podstawkę

w kształcie plastra miodu, w celu wytworzenia komory

wilgotnej.

Zanotować numer szczepu na wydłużonej części

podstawki. (Nie notować numeru na pokrywce,

ponieważ może ona ulec zamianie w trakcie badań).

Wyjąć pasek z indywidualnego opakowania.

Umieścić pasek w komorze inkubacyjnej.

Przygotowanie inokulum

Otworzyć ampułkę API Suspension Medium (2 ml)

zgodnie z paragrafem "Środki ostrożności” lub użyć

jakąkolwiek probówkę zawierającą 2 ml wody

destylowanej bez dodatków.

Używając wymazówkę zebrać wszystkie bakterie, które

wyrosły na płytce z przygotowaną hodowlą wtórną.

Przygotować gęstą zawiesinę o zmętnieniu

odpowiadającym gęstości przekraczającej 4 w skali

McFarlanda. Zawiesinę tę użyć natychmiast po

sporządzeniu.



Napełnianie paska

Zawiesinę tę nanieść do pierwszej części paska (testy

od VP do ADH), unikając tworzenia pęcherzyków

(nachylić lekko pasek do przodu i trzymać końcówkę

pipety lub PSIpety przy ściance wgłębienia) :

- Do testów od VP do LAP : nanieść po około 100 µl do

każdej mikroprobówki.

- Dla tetsu ADH: napełnić wyłącznie probówkę.

Dla drugiej części paska (testy od RIB do GLYG):

- Otworzyć ampułkę API GP Medium zgodnie

z paragrafem "Środki ostrożności" i przenieść do niej

resztę zawiesiny (około 0.5 ml). Dobrze wymieszać.

- Nanieść tę nową zawiesinę wyłącznie do probówek.

Napełnić wgłębienia podkreślonych testów (od ADH do

GLYG) olejem mineralnym, aby utworzył się menisk

wypukły.


Przykryć podstawkę pokrywką.

Inkubować w 36°C ± 2°C w warunkach tlenowych przez

4 - 4 ½ godziny, aby dokonać pierwszego odczytu

i przez 24 godziny (± 2 godziny), aby dokonać drugiego

odczytu, jeśli jest to konieczne.

ODCZYT I INTERPRETACJA

Odczyt paska

Po 4 godzinach inkubacji:

Dodać odczynników:

- Test VP : po 1 kropli VP 1 i VP 2.

- Test HIP : 2 krople NIN.

- Testy PYRA, GAL, ßGUR, ßGAL, PAL i LAP :

po 1 kropli ZYM A i ZYM B.

Odczekać 10 minut, później odczytać wszystkie reakcje

przez porównanie z Tabelą Odczytów. Jeśli to

konieczne, wystawić pasek na działanie silnego światła

(10 sekund pod lampą 1000 W), aby odbarwić nadmiar

odczynników od PYRA do LAP.

api® 20 Strep 07625E - PL - 2003/01

bioMérieux® sa Polski - 3

Dalsza inkubacja jest konieczna:

- jeśli nie można znaleźć profilu w Książce Kodowej dla

API 20 Strep

- jeśli profil jest podany z następującą uwagą:

IDENTYFIKACJA NIE DO ZATWIERDZENIA

PRZED UPŁYWEM 24 GODZIN INKUBACJI

W tym przypadku, po 24 godzinach, powtórnie odczytać

reakcje ESC, ADH i od RIB do GLYG. Nie odczytywać



powtórnie reakcji enzymatycznych (HIP, PYRA, GAL,

ßGUR, ßGAL, PAL, LAP) i VP. Zapisać wyniki wszystkich

reakcji na karcie wyników.

Interpretacja

Identyfikację otrzymuje się z profilu numerycznego.

Określanie profilu numerycznego:

Na karcie wyników testy podzielone są na grupy po 3,

każdy odpowiednio o wartości 1, 2 lub 4. Przez dodanie

do siebie wartości odpowiadających pozytywnym

reakcjom w obrębie każdej grupy otrzymuje się

7 cyfrowy profil numeryczny.

Identyfikacja:

Uzyskuje się ją używając bazy danych (V6.0)

* z Książki Kodowej:

- Odszukać właściwy profil numeryczny na liście profili.

* z oprogramowania komputerowego:

- Wprowadzić 7 cyfrowy profil numeryczny manualnie

przy użyciu klawiatury.

5 240 550 / 5 240 770 Streptococcus mutans

UWAGA: Reakcja hemolizy stanowi 21. test; ß-hemoliza

jest uważana za wynik pozytywny z liczbową wartością

równą 4. Inne wyniki reakcji hemolizy uważa się za

ujemne z wartością liczbową 0. Niemniej jednak, test ten

może mieć wartość rozstrzygającą dla identyfikacji

niektórych gatunków.



KONTROLA JAKOŚCI

Podłoża, paski i odczynniki są systematycznie poddawane kontroli jakości na różnym poziomie procesu produkcji. Dla

tych użytkowników, którzy chcą prowadzić swoją własną kontrolę pasków zaleca się szczep 1. Streptococcus equi spp

zooepidemicus ATCC 700400 lub jeden z następujących szczepów:

2. Streptococcus uberis ATCC 700407

ATCC : American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA.

VP HIP ESC PYRA GAL ßGUR ßGAL PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG



1. – – – – – + – + + + + – – + + – – – + +

2. + + + V V + – –* + + + – + + + + + + – –

* Wynik ten może się różnić w zależności od użytego podłoża.

Odpowiednia gęstość inokulum wyznaczona przy użyciu DENSIMATU zawiera się między 4.5 a 5.5 McF.

Profile otrzymane po: - 4 godzinach inkubacji dla testów od VP do LAP

- 24 godzinach inkubacji dla testów od ADH do GLYG.

Szczepy hodowane na agarze Columbia z krwią baranią.

Użytkownik jest zobowiązany do prowadzenia kontroli jakości zgodnie z lokalnymi przepisami.



OGRANICZENIA METODY

System API 20 Strep służy jedynie do identyfikacji

gatunków zawartych w bazie danych (patrz Tabela

Identyfikacyjna na końcu instrukcji). Nie może być

używany do identyfikacji innych mikroorganizmów lub

wykluczania ich obecności.

Należy używać tylko czysto wyizolowanych bakterii.

.










©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna