Rozprawa doktorska Promotor: prof dr hab med. Janusz Marcinkiewicz



Pobieranie 233.23 Kb.
Strona3/11
Data07.05.2016
Rozmiar233.23 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

1.3 Biologiczne właściwości chloraminy i bromaminy tauryny


Do najlepiej zbadanych pochodnych tauryny należy chloramina tauryny (TauCl) [Thomas i wsp., 1986; Park i wsp., 1993; Marcinkiewicz i wsp., 1995; Park i wsp., 1995; Quinn i wsp., 1996; Park i wsp., 1997; Marcinkiewicz i wsp., 1998; Marcinkiewicz i wsp., 1999]. Powstaje ona in vivo w reakcji pomiędzy tauryną a HOCl – podstawowym produktem mieloperoksydazy obecnej w neutrofilach i monocytach [Weiss i wsp., 1982] lub też w procesie bezpośredniego chlorowania tauryny przez MPO z udziałem H2O2 i Cl- (bez wytwarzania HOCl) [Marquez i Dunford, 1994]. HOCl, silny i wysoce reaktywny oksydant, uważany jest za jeden z podstawowych związków bakteriobójczych uwalnianych przez aktywne neutrofile do wnętrza fagolizosomu. TauCl jest związkiem znacznie stabilniejszym i mniej reaktywnym. Jej działanie bakteriobójcze potwierdzono zarówno in vitro, jak i in vivo; aktualnie jej zastosowanie miejscowe w leczeniu infekcji (przede wszystkim w okulistyce i laryngologii) jest przedmiotem badań klinicznych II fazy [Nagl i wsp., 2000a; Nagl i wsp., 2000b; Neher i wsp., 2004; Neher i wsp., 2005; Teuchner i wsp., 2005]. W ostatnim czasie opublikowano wyniki badań właściwości chemicznych i bakteriobójczych dichloraminy tauryny, jednakże w porównaniu z TauCl związek ten wydaje się mniej obiecujący w aspekcie potencjalnego zastosowania klinicznego [Gottardi i wsp., 2005].

Zarówno HOCl, jak i TauCl mogą przyczyniać się do uszkodzenia białek macierzy zewnątrzkomórkowej – czy to bezpośrednio poprzez ich chlorowanie [Olszowska i wsp., 1989], czy też pośrednio poprzez aktywację kolagenazy uwalnianej z granulocytów [Claesson i wsp., 1996].

Z drugiej strony w wielu pracach wykazano in vitro działanie immunomodulacyjne TauCl polegające na hamowaniu wytwarzania NO, PGE2, TNF- oraz IL-6 przez aktywne makrofagi [Park i wsp., 1993; Marcinkiewicz i wsp., 1995; Park i wsp., 1995; Park i wsp., 1997]; co więcej, hamuje ona również wytwarzanie mediatorów zapalenia oraz aktywnych form tlenu przez neutrofile [Marcinkiewicz i wsp., 1998] oraz produkcję cytokin przez synowiocyty w reumatoidalnym zapaleniu stawów [Kontny i wsp., 2000]. Tym samym TauCl wydaje się odgrywać istotną rolę w hamowaniu nieswoistej reakcji zapalnej i promowaniu swoistej odpowiedzi immunologicznej [Marcinkiewicz 1997].

Możliwości zastosowania TauCl do modyfikacji przebiegu przewlekłego zapalenia są aktualnie przedmiotem badań in vivo [Kwaśny-Krochin i wsp., 2002; Wojtecka-Łukasik i wsp., 2004; Verdrengh i Tarkowski, 2005; Wojtecka-Łukasik i wsp., 2005]. Jakkolwiek szybki rozkład TauCl in vivo pociąga za sobą konieczność jej częstego, miejscowego podawania i tym samym znacznie ogranicza jej przewlekłe stosowanie, związek ten mógłby znaleźć zastosowanie w terapii takich schorzeń jak reumatoidalne zapalenie stawów.

W przeciwieństwie do TauCl na temat TauBr dostępnych w literaturze danych jest jak dotychczas niewiele. In vivo powstaje ona w reakcji pomiędzy tauryną a HOBr – produktem peroksydazy eozynofilów [Jong i wsp., 1980; Thomas i wsp., 1995]. Jak dotychczas wykazano jej działanie przeciwbakteryjne i przeciwpasożytnicze [Yazdanbakhsh i wsp., 1987], jej funkcja immunomodulacyjna pozostaje jednak słabo poznana. W badaniach in vitro stwierdzono, że TauBr – podobnie jak TauCl – indukuje w sposób zależny od dawki ekspresję oksygenazy hemowej-1 (HO-1) w makrofagach równocześnie obniżając poziom syntazy tlenku azotu (NOS-2) oraz hamując wytwarzanie TNF-L-6, IL-12 i IL-10 przez aktywne makrofagi [Olszanecki i Marcinkiewicz, 2004; Marcinkiewicz i wsp., 2005].

2. Cel pracy

Badania nad właściwościami i mechanizmami działania TauCl potwierdziły przeciwbakteryjne i przeciwzapalne działanie TauCl w stężeniach fizjologicznych, niecytotoksycznych dla komórek odczynu zapalnego. Wyniki tych badań uzasadniają stosowanie TauCl in vivo w leczeniu schorzeń infekcyjnych.

Rola TauBr in vivo pozostaje niewyjaśniona. Z badań in vitro wynika jednak, że TauBr posiada szereg cech wspólnych z TauCl (wykazuje silniejsze działanie przeciwbakteryjne, słabsze natomiast immunomodulacyjne), co wskazuje na możliwość zastosowania TauBr in vivo.

Celem pracy było zbadanie tych cech i właściwości obu związków, które uzasadniałyby terapeutyczne zastosowanie TauBr w leczeniu ostrego odczynu zapalnego.


Realizacja założonego celu wymagała opracowania odpowiednich modeli doświadczalnych zarówno in vitro, jak i in vivo. Do eksperymentów in vitro wybrano linie komórkowe będące odpowiednikami głównych komórek uczestniczących w odczynie zapalnym – leukocytów (otrzewnowe makrofagi rezydentne myszy CBA/J oraz komórki mysich linii makrofagowych RAW 264.7 i J774.2) i śródbłonka naczyń (mysia linia ECV 304 oraz komórki HUVEC). Eksperymenty in vivo prowadzono w modelu ostrego odczynu zapalnego w komorze powietrznej („air pouch”), umożliwiającym odzyskiwanie wysięku zapalnego oraz izolację napływających do miejsca zapalenia aktywnych leukocytów (bez obecności komórek rezydentnych).

Cele pracy zrealizowano poprzez następujące szczegółowe zadania badawcze:



Zadania wstępne:

  1. Określenie trwałości TauBr i TauCl (zarówno w warunkach laboratoryjnych, jak i w warunkach ostrego odczynu zapalnego) oraz ich właściwości fizykochemicznych istotnych dla działania in vivo.

  2. Zbadanie cytotoksyczności TauBr i TauCl in vitro oraz in vivo.

  3. Ustalenie drogi transportu TauCl przez błonę komórkową do wnętrza komórki.

Zadania zasadnicze:

  1. Zbadanie wpływu TauBr i TauCl in vitro na aktywność komórek odczynu zapalnego.

  2. Zbadanie wpływu TauBr i TauCl in vivo na przebieg ostrego odczynu zapalnego.



3. Materiały i metody




3.1 Odczynniki


Płodowa surowica cielęca (FCS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA); błękit trypanu (Searle Diagnostics, High Wycombe Bucks, UK); L-tauryna, hypotauryna, perhydrol, 1% Triton, zymosan A, luminol, olej parafinowy, MTT, standard mysiego TNF-α (Sigma, St. Louis, MO, USA); NaOCl, o fenylodiamina, heksadecylotrimetyloamina, o-dianizydyna, rekombinowany mysi TNF-α, rekombinowany IFN-γ, lipopolisacharyd E. coli 0.111:B4 (LPS) (Aldrich, Steinham, Niemcy); izopropanol, glukoza, H3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4, NaCl, NaBr, KCl, CaCl2, NaNO2, HCl, H2SO4, kwas sulfanilowy, NDD (P.O.Ch. S.A., Gliwice, Polska); tauryna znakowana trytem (Polatom, Otwock, Polska); heparyna (Polfa, Warszawa, Polska); podłoża: RPMI 1640, DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA); szczurze przeciwciała monoklonalne: przeciw mysiej IL-6 (MP5-20F3 i MP5 32C11), przeciw mysiej IL-10 (JES5-2A5 i JES5-16E3), przeciw mysiej IL-12 (p40) (C15.6), przeciw mysiemu TNF-α (TN3 19.12) oraz biotynylowane szczurze przeciwciało poliklonalne przeciw mysiemu TNF-α (Pharmingen, San Diego, CA, USA); biotynylowane szczurze przeciwciało monoklonalne przeciw mysiej IL-12 (p40) (C17.8) (Endogen, Woburn, USA); rekombinowana mysia IL-6 (PeproTech, Rocky Hill, USA); rekombinowane mysie interleukiny: IL-10 i IL-12 (Genzyme, Cambridge, UK); Streptavidin HRP (Vector, Burlingame, CA, USA); mysie przeciwciało monoklonalne przeciw HO-1 (Stressgen, Canada); mysie przeciwciało monoklonalne przeciw COX-2 (Cayman, USA); odtłuszczone mleko w proszku (Marvel, Dublin, Irlandia).

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna