Rozprawa doktorska Promotor: prof dr hab med. Janusz Marcinkiewicz



Pobieranie 233.23 Kb.
Strona4/11
Data07.05.2016
Rozmiar233.23 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

3.2 Materiały i aparatura


Naczynia hodowlane typu Leighton (Bellco, USA); płytki Petriego o średnicy 100 mm, butelki hodowlane o pojemności 50 i 150 ml, płytki 6- i 96-dołkowe płaskodenne, probówki plastikowe o pojemności 15 i 50 ml (Costar, Cambridge, MA, USA); żel poliakrylamidowy (Bio Rad, USA); błony nitrocelulozowe (Amersham Pharmacia Biotech, USA); płytki do chemiluminescencji (Nunc, Roskilde, Dania); Parafilm „M” (American National Can™, Greenwich, CT, USA); skrobaczka do komórek (cell scraper) (diSpo, McGaw Park, IL, USA); igły jednorazowe 27G ½ (Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA); filtry o średnicy porów 0,2 m (Renner, Dannstadt, Niemcy); wytrząsarka (GFL Burgwedel, Niemcy); wirówka, komora laminarna, inkubator z przepływem CO2 (Heraeus Sepatech, Hanau, Niemcy); luminometr „Lucy” (Anthos, Salzburg, Austria); spektrofotometr „PowerWave X” (Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA); licznik scyntylacyjny (Wallac, Turku, Finlandia).

3.3 Model doświadczalny in vitrozałożenia


W celu wykazania wpływu TauCl i TauBr na przebieg odczynu zapalnego zaplanowano w pierwszej kolejności badania in vitro przy użyciu hodowli komórek biorących udział w ostrym odczynie zapalnym. W oparciu o dotychczasowe badania i publikacje Katedry Immunologii wytypowano do badań następujące komórki uczestniczące w rozwoju odczynu zapalnego:

  • makrofagi: mysie makrofagi otrzewnowe oraz komórki mysich linii makrofagowych RAW 264.7 i J774.2;

  • komórki śródbłonka: komórki HUVEC (ludzkie komórki śródbłonka izolowane z żyły pępowinowej) oraz komórki ludzkiej linii śródbłonkowej ECV 304.

Zaplanowano przeprowadzenie następujących badań:

  • określenie cytotoksyczności TauCl i TauBr wobec badanych komórek;

  • ustalenie drogi transportu TauCl przez błonę komórkową;

  • zbadanie wpływu TauCl i TauBr na syntezę i uwalnianie tlenku azotu i wybranych cytokin przez aktywowane komórki;

  • zbadanie wpływu TauCl i TauBr na ekspresję HO-1 i COX-2.



3.3.1 Izolacja makrofagów otrzewnowych


W celu uzyskania makrofagów otrzewnowych myszom CBA/J podawano dootrzewnowo 1 ml oleju parafinowego (Sigma, ST. Louis, USA). Komórki odzyskiwano po 48 h przepłukując jamę otrzewnową 5 ml DPBS z dodatkiem heparyny (5 U/ml; Polfa, Warszawa). Następnie zawiesinę komórek wirowano, a komórki zawieszano ponownie w DPBS. Obecność makrofagów (85-90%) potwierdzano metodą cytochemiczną – poprzez wykazanie obecności niespecyficznych komórek jednojądrzastych zawierających esterazę.

3.3.2 Hodowle komórkowe


Komórki śródbłonka (linia ECV 304 i komórki HUVEC) oraz mysie komórki makrofagowe (linia J774.2) hodowano w medium DMEM (Gibco, USA) wzbogaconym 10% FCS oraz streptomycyną (100 μg/ml), penicyliną (100 U/ml) i fungizonem (0,25 μg/ml). Komórki linii makrofagowej RAW 264.7 hodowano w medium RPMI wzbogaconym 10% FCS w obecności gentamycyny (50 mg/l).

Wszystkie hodowle prowadzono w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2.

O ile nie podano inaczej, przed każdym eksperymentem komórki wysiewano na płytkę 96 dołkową i hodowano do uzyskania pojedynczej, adherentnej warstwy komórek. Jedynie eksperymenty z zastosowaniem techniki Western blot prowadzono przy użyciu płytek sześciodołkowych w celu uzyskania odpowiednio dużej ilości materiału do analizy.

O ile nie podano inaczej, substancje aktywujące komórki (LPS i IFN-γ w przypadku komórek makrofagowych oraz IL-1β dla komórek śródbłonka) dodawano do układu po 15 min. od podania TauCl lub TauBr.



3.3.3 Synteza chloraminy i bromaminy tauryny


Chloraminę i bromaminę tauryny syntetyzowano drogą reakcji pomiędzy tauryną i – odpowiednio – NaOCl lub NaOBr; metoda syntezy została opracowana w Zakładzie Immunologii CM UJ i opublikowana we wcześniejszych pracach [Marcinkiewicz i wsp., 1995].

W celu uzyskania TauCl krystaliczną L taurynę (Sigma, St. Louis, USA) rozpuszczano w DPBS (pH = 7,4) do uzyskania stężenia 40 mM; analogicznie przygotowywano 35-40 mM roztwór NaOCl (Aldrich, Steinham, Niemcy) w DPBS (pH = 10,0 – 11,0). Następnie 5 ml roztworu NaOCl dodawano po kropli do 5 ml roztworu tauryny, ciągle mieszając.

Dla uzyskania TauBr przygotowywano najpierw roztwór NaOBr poprzez reakcję NaOCl z niewielkim nadmiarem NaBr [Thomas i wsp., 1995]. Uzyskany roztwór NaOBr rozcieńczano w DPBS do stężenia 10-12 mM i mieszano z roztworem tauryny o stężeniu 100 mM w sposób opisany powyżej.

Zawartość TauCl i TauBr w produkcie końcowym oraz obecność ewentualnych zanieczyszczeń (przede wszystkim TauCl2 i TauBr2) określano spektrofotometrycznie (spektrometr PowerWave X, Bio-tek Instruments, Inc.) przy pH = 7,4. Parametry badanych substancji (λmax, A) zestawiono w tabeli 1. [Thomas i wsp., 1986; Thomas i wsp., 1995]



Tab. 1. Dane spektrofotometryczne badanych pochodnych tauryny.

Związek

TauCl

TauBr

TauCl2

TauBr2

Absorbancja (M-1 * cm-1)

429

430













λmax (nm)

252

288

207

300

241

336


3.3.4 Ocena żywotności komórek – test MTT


Żywotność komórek hodowanych in vitro oceniano przy pomocy testu redukcji soli tetrazolowej (MTT) do formazanu przez dehydrogenazy żywych komórek. Komórki śródbłonka (linia ECV 304) lub mysie komórki makrofagowe (linia J774.2 bądź RAW 264.7) hodowano na płytce 96-dołkowej do uzyskania pojedynczej, adherentnej warstwy komórek. Następnie wymieniano medium nakładając po 180 μl/dołek + 20 μl roztworu TauCl lub TauBr w DPBS tak, aby docelowe stężenie badanego związku w mieszaninie inkubacyjnej wynosiło od 0,03 do 10 mM. Po 24 godzinach inkubacji usuwano supernatant i nakładano świeże medium (po 180 μl/dołek) z dodatkiem MTT (roztwór w jałowej soli fizjologicznej; stężenie 4 mg/ml, 20 μl/dołek). Po dalszych 2 godzinach inkubacji usuwano nadsącz, a komórki umieszczano w temperaturze -20°C do następnego dnia. Po rozmrożeniu komórki zalewano izopropanolem z dodatkiem 0,04 M kwasu solnego (200 μl/dołek) celem rozpuszczenia wytrąconych kryształów formazanu. Stężenie produktu końcowego oceniano mierząc absorpcję dla λ = 550 nm.

3.3.5 Ocena żywotności komórek – test zahamowania wchłaniania błękitu trypanu


Żywotność komórek in vivo określano poprzez ocenę zdolności zahamowania wchłaniania do komórki błękitu trypanu, tj. pośrednią ocenę integralności błony komórkowej. Myszom szczepu CBA (wiek 6-8 tygodni) podawano dootrzewnowo roztwór TauCl lub TauBr w jałowym DPBS o stężeniu 1-7 mM w ilości 1 ml. Po 60 min. wypłukiwano rezydualne makrofagi otrzewnowe, wirowano i ponownie zawieszano w 1ml DPBS, a następnie dodawano błękit trypanu. Odsetek żywych (tj. nie wybarwionych) komórek oceniano w komorze Bürkera.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna