Ćwiczenie 2 Oczyszczanie i metody badań makrocząsteczek życia



Pobieranie 18.94 Kb.
Data06.05.2016
Rozmiar18.94 Kb.
Ćwiczenie 2

Oczyszczanie i metody badań makrocząsteczek życia.

Pomoce do zaopatrzenia się przez studenta: 2 kartki papieru milimetrowego, ołówek



  1. Wykreślanie widma absorpcji dla białek

  1. Na spektrofotometrze Biomate 3 wybrać program General Tests, następnie program Multiwavelenght, następnie Run Test.

  2. Przygotować próbę ślepą (Blank). Pobrać 1000 µl wody i mierzyć próbę ślepą (Measure Blank). Wyjąć kuwetę, przepłukać wodą destylowaną, wysuszyć.

  3. Z otrzymanej próbki białka pobrać 1000 µl i dodać do kuwety. Kuwetę umieścić w spektrofotometrze i mierzyć próbkę (Measure Sample)

  4. Wartości absorbancji dla określonej długości fali umieścić w Tabeli 1


Długość

fali


Absorbancja































Tabela 1.



  1. Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczyć, na papierze milimetrowym widmo absorpcji dla białka, gdzie na osi odciętych (oś X) umieścić wartości długości fali, a na osi rzędnych (oś Y) wartości Absorbancji. Zaznacz maksimum absorpcji.

  2. Próbkę przenieść do probówki 1,5 ml typu eppendorf do późniejszego wykorzystania



  1. Przygotowanie krzywej wzorcowej oraz oznaczanie stężenia białka metodą pomiaru spektrofotometrycznego przy długości fali 280 nm.



  1. Przygotowanie krzywej wzorcowej białka:

  1. Z roztworu o stężeniu białka 1mg/ml (roztwór albuminy bydlęcej – BSA w wodzie) obliczyć odpowiednie rozcieńczenia roztworu białka w wodzie, aby objętość przygotowanej próbki wynosiła 1 ml. Wyniki obliczeń umieścić w tabeli 2.



Stężenie roztworu

µl roztworu BSA

µl H20

Absorbancja

100 µg/ml










250 µg/ml










500 µg/ml










1000 µg/ml










Próbka nr

Stężenie na podstawie krzywej wzorcowej:




Tabela 2. Pomiar przy długości fali 280 nm

  1. Przygotować stężenia w 4 probówkach 1,5 ml typu eppendorf według obliczeń umieszczonych w tabeli. Oznaczamy probówki jako zestaw 1 wpisując także wartości stężeń. Z każdej z probówek pobieramy po 20 µl i umieszczamy w 4 następnych probówkach 1,5 ml typu eppendorf. Próbki te oznaczamy jako zestaw 2 wpisując także wartości stężeń. Zostaną one wykorzystane w późniejszej części ćwiczeń do oznaczeń kolorymetrycznych metodą Bradforda.

  2. Na Spektrofotometrze BioMate 3 wyszukać programu Protein Tests i szukać Protein Conc. (280).

  3. Do kuwety odmierzyć 980 µl wody jako próbę ślepą. Mierzyć absorbancję przy długości fali 280 nm. (Run Test --- Measure Blank). Płukać kuwetę i dodać próbkę pierwszego roztworu standardowego (100 µg/ml). Mierzyć przy długości fali 280 nm (Measure Sample). Wynik zapisujemy w tabeli 2. Tak postępujemy dla każdego z przygotowanych stężeń. Wyniki zapisujemy w tabeli.

  4. Na podstawie uzyskanych wyników wykreślić, na papierze milimetrowym krzywą wzorcową, gdzie na osi odciętych (oś X) umieszczamy wartości stężenia, a na osi rzędnych (oś Y) wartości Absorbancji.



  1. Pomiar stężenia białka w nieznanej próbce.



  1. Przygotować spektrofotometr jak w pkt. 2Ic

  2. Przygotować próbę ślepą jak w punkcie 2Id, zmierzyć wartość próby ślepej

  3. Z otrzymanej próbki o nieznanym stężeniu pobrać 980 µl i umieścić w wypłukanej i wysuszonej kuwecie. Zmierzyć absorbancje tak jak w pkt. 2Id

  4. Nr próbki oraz wartość absorbancji umieszczamy w tabeli 2.

  5. Na podstawie wcześniej wyznaczonej krzywej wzorcowej określamy stężenie białka. Wpisujemy je do tabeli 2.





©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna