Zasada metody



Pobieranie 25.37 Kb.
Data02.05.2016
Rozmiar25.37 Kb.

ĆWICZENIE 1


OZNACZANIE STĘŻENIA BILIRUBINY CAŁKOWITEJ W SUROWICY

ZASADA METODY

Bilirubina zawarta w surowicy reaguje z dwuazowanym kwasem sulfanilowym tworząc rozpuszczalną w wodzie azobilirubinę, która ma różowe zabarwienie w środowisku kwaśnym. W reakcji tej możliwe jest rozróżnie­nie bilirubiny bezpośredniej, reagującej bez udziału akceleratora i bilirubiny pośredniej, która reaguje w jego obecności. Suma obu form powstających w reakcji, w obecności akceleratora, nazywana jest bilirubiną całkowitą. W zastosowanej metodzie akceleratorem jest dimetylosulfotlenek (DMSO). Intensywność zabarwienia powstającej azobilirubiny jest wprost proporcjo­nalna do stężenia odpowiedniej formy bilirubiny w surowicy.


MATERIAŁ BADANY


Surowica

ODCZYNNIKI


  1. Odczynnik (kwas sulfanilowy 16 mmol z dodatkiem DMSO w rozcień­czonym kwasie solnym)

  2. Kalibrator - odpowiadający stężeniu bilirubiny 5 mg/dl

  3. Roztwór roboczy (odczynnik - a) i azotyn sodu w stosunku 10.1

WYKONANIE





Odmierzyć (ml)

Próba badana

Próba badana kompensacyjna

Próba kalibracyjna

Próba kalibracyjna kompensacyjna

roztwór roboczy

1

-

1

-

surowica

0,05

0,05

-

-

kalibrator

-

-

0,05

0,05

odczynnik

-

1

-

1

Każdą z prób inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej, w ciem­nym miejscu, odczytać absorbancje przy długości fali  = 540 nm, wzglę­dem wody.



OBLICZENIA

stężenie bilirubiny (mg/dl) =

gdzie:

Abad. - absorbancja próby badanej



Akomp. bad. - absorbancja próby badanej kompensacyjnej

Akal. - absorbancja próby kalibracyjnej

Akomp. kal. - absorbancja próby kalibracyjnej kompensacyjnej
ĆWICZENIE 2
OZNACZANIE KWASU DELTA-AMINOLEWULINOWEGO W MOCZU


ZASADA METODY

Kwas delta-aminolewulinowy (ALA) jest prekursorem porfiryn. Po­wstaje on z sukcynylo-CoA i glicyny. Reakcja ta katalizowana jest przez syntazę 8-aminolewulinową. ALA w obecności acetyloacetonu w temperaturze około 100°C kondensuje na porfobilinogen, który w reakcji z od­czynnikiem Ehrlicha daje produkt o barwie różowej proporcjonalnie do ilo­ści porfobilinogenu, a pośrednio do ilości ALA.


MATERIAŁ BADANY


Mocz

ODCZYNNIKI


  1. Acetyloaceton

  2. Bufor octanowy o pH 4,6

  3. Odczynnik Ehrlicha

  4. Wzorzec macierzysty ALA -1 mg/ml

WYKONANIE


Próba badana:

Do probówki z korkiem odmierzyć 0,5 ml badanego moczu + 0,1 ml acetyloacetonu i mieszać zawartość silnie wytrząsając. Zawartość probówki do­pełnić buforem octanowym do 5 ml. Ogrzewać 10 minut w łaźni wodnej wrzącej, po czym ostudzić pod bieżącą wodą. 1 ml płynu przenieść do innej probówki i zmieszać z 1 ml odczynnika Ehrlicha. Dokładnie po 15 inutach odczytać ekstynkcję wobec próby ślepej na spekolu w kuwetach 1 cm przy długości fali  = 553 nm.



Próba ślepa:

0,5 ml badanego moczu + 4,5 ml buforu octanowego.

Ogrzewać 10 minut w łaźni wodnej wrzącej i dalej postępować jak z próbą badaną.
Wykonanie wykresu kalibracyjnego:

Z roztworu wzorca macierzystego (ALA) przygotować szereg rozcieńczeń.


Tabela 1

Numer próbki

Wzorzec macierzysty (ml)

Woda destylowana (ml)

Stężenie (ALA)
mg/dl

1

0,05

9,95

0,5

2

0,1

9,9

1,0

3

0,2

9,8

2,0

4

0,3

9,7

3,0

5

0,4

9,6

4,0

6

0,5

9,5

5,0

Z każdego rozcieńczenia odmierzyć 0,5 ml, dodać po 0,1 ml acetyloacetonu i dalej postępować jak z próbą badaną. Pomiary – wobec próby śle­pej: 0,5 ml wody destylowanej + 4,5 ml buforu octanowego. Ogrzewać 10 minut w łaźni wodnej wrzącej i dalej postępować jak z próbą badaną.



OBLICZENIA


Z wykresu kalibracyjnego odczytać stężenie ALA w mg/dl moczu i znając dobową zbiórkę moczu przeliczyć wydalanie ALA na dobę


©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna