Zbm 4 Charakterystyka spektralna barwników fotosyntetycznych Krzysztof Gibasiewicz Czas trwania ćwiczenia



Pobieranie 27.6 Kb.
Data28.04.2016
Rozmiar27.6 Kb.
ZBM_4 Charakterystyka spektralna barwników fotosyntetycznych

Krzysztof Gibasiewicz


Czas trwania ćwiczenia:

15 godzin lekcyjnych podzielonych na dwa (preferowany wariant) lub trzy spotkania w salach II PF).


Wymagania wobec studentów:

Pisemna wejściówka na początku zajęć. Protokół pisemny na zakończenie (ewentualna obrona protokołu).

Na pierwsze zajęcia studenci przynoszą kilka gramów liści dwóch różnych roślin.

Na drugie zajęcia studenci pryznoszą 20-30 g świeżych liści szpinaku, pietruszki, rzodkiewki lub ewentualnie innych roślin.


Cel ćwiczenia:

Zasadniczym celem ćwiczenia jest zapoznanie się z właściwościami spektralnymi barwników fotsyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu). W tym celu zostaną przeprowadzone pomiary widm absorpcji i fluorescencji:

A) mieszaniny barwników fotosyntetycznych wyekstrahowanych z liści szpinaku (i ewentualnie innych roślin) za pomocą:

- acetonu,

- alkoholu metylowego;

B) izolowanych barwników fotsyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu);

C) chloroplastów szpinaku (i ewentualnie innych roślin).
Cele szczegółowe doświadczeń obejmują:

1) Określenie procentowej zawartości chlorofilu a i b w liściach różnych roślin.

2) Zbadanie wpływu różnych rozpuszczalników organicznych na właściwości spektralne barwników fotosyntetycznych (aceton, alkohol metylowy).

3) Porównanie widm emisji mieszaniny barwników fotosyntetycznych przy selektywnym wzbudzeniu chlorofilu a i chlorofilu b.

4) Porównanie widm absorpcji i emisji chlorofilu a i chlorofilu b.

5) Porównanie widma absorpcji z widmem wzbudzenia dla chlorofilu a oraz dla chlorofilu b.

6) Porównanie widma absorpcji z widmem emisji dla chlorofilu a oraz dla chlorofilu b – pomiar przesunięcia Stokesa.

7) Zbadanie wpływu otoczenia białkowego na widmo absorpcji i emisji barwników fotosyntetycznych.

8) Obserwacja przenoszenia energii wzbudzenia elektronowego w komplekasach białkowo-barwnikowych chloroplastów.
Opis doświadczeń:

Ad. A. Badanie mieszaniny wyekstrahowanych barwników fotosyntetycznych

Pierwsza część doświadczeń polega na wyekstrahowaniu mieszaniny barwników fotosyntetycznych z liści szpinaku (i ewentualnie innych roślin przyniesionych przez studentów – pietruszka, rzodkiewka, igły sosny, ...) i pomiarach widm absorpcji, emisji i wzbudzenia tej mieszaniny.


Kolejność czynności:

ABSORPCJA - RÓŻNE PRÓBKI

1) Odważyć ok. 2 g liści szpinaku i dwóch innych roślin.

2) Każdą z próbek starannie (przez kilka minut) homogenizować w ok. 15 ml (schłodzonego do 0°C) acetonu poprzez ucieranie w moździerzu (gumowe rękawiczki!).

3) Otrzymane zawiesiny przesączyć przez kilka warstw gazy (lub bibułę) do

kolb lub zlewek (30-100 ml) owiniętych folią aluminiową (gumowe rękawiczki!).

4) Zmierzyć objętość otrzymanego ekstraktu i wprowadzić do niego wodę destylowaną w o objętości cztery razy mniejszej niż objętość ekstraktu (w celu otrzymania 80 % wodnego roztworu acetonu).

5) Celem pozbycia się dużych cząsteczek odwirować próbki (10 minut, 10 000 rpm), a uzyskany supernatant ewentualnie dodatkowo przefiltrować (gumowe rękawiczki!) pod nadzorem osoby prowadzącej.

6) Zmierzyć widmo absorpcji ekstraktu w zakresie 380 -750 nm. Próbka referencyjna - 80% wodny roztwór acetonu. Rozcieńczyć (używając 80% wodny roztwór acetonu) roztwory próbek tak, aby uzyskać absorbancję równą około jeden w maksimum pasma Qy (przy ok. 660 nm). Powtórzyć pomiary widm. Zapisać je.

7) Odczytać absorbancję przy długości fali: 645, 652 i 663 nm.

8) Zawartość chlorofilu a (ca), chlorofilu b (cb) oraz oraz całkowitą zawartość chlorofilu (wyrażoną w mg/l) należy wyliczyć z następujących wzorów:

ca = 12,7 A663 – 2,7 A645 (1)

cb = 22,9 A645 – 4,7 A663 (2)

ca + cb = 20,2 A645 + 8,0 A663 (3)

ca + cb = 27,8 A652 (4)

Sprawdzić i przedyskutować zgodność wyników otrzymanych ze wzoru (3) (otrzymanego ze wzorów (1) i (2)) i wzoru (4).

9) Obliczyć i porównać stosunek stężeń chlorofilu a do chlorofilu b dla badanych próbek.

10) Porównać na jednym wykresie widma absorpcji trzech próbek znormalizowanych w maksimum pasma Qy.


ABSORPCJA - RóżNE ROZPUSZCZALNIKI

11) Dla jednej z próbek powtórzyć punkty 1-5 zastępując aceton alkoholem metylowym.

12) Porównać widma absorpcji próbki w dwóch różnych rozpuszczalnikach (znormalizowane jak w p. 9); określić położenia maksimów.
FLUORESCENCJA – WIDMA EMISJI

13) Zmierzyć i porównać widma emisji w zakresie do 750 nm trzech przygotowanych wcześniej próbek w acetonie oraz próbki w alkoholu metylowym. Określić długości fali maksimów fluorescencji. Użyć przynajmniej dwóch różnych długości fali światła wzbudzającego celem selektywnego wzbudzenia chlorofilu a (np. 400 lub 420 nm) i chlorofilu b (470 lub 480 nm). Stężenie badanych próbek powinno być tak dobrane, aby absorbancja w maksimum pasma Qy wynosił ok. 1.

14) Na podstawie uzyskanych widm wyciągnąć wnioski co do skuteczności selektywnego wzbudzania chlorofilu a i chlorofilu b.
FLUORESCENCJA – WIDMA WZBUDZENIA

15) Zmierzyć widma wzbudzenia przynajmniej dla jednej z próbek w zakresie 350 nm – 750 nm dla λem = 650, 660, 680, 690 i 700 nm.

16) Przedyskutować kształt uzyskanych widm, porównując je z widmami absorpcji chlorofilu a i b (patrz niżej) oraz ekstraktu barwników fotosyntetycznych (patrz wyżej).
PRZESUNIĘCIE STOKESA

17) Porównać na jednym wykresie znormalizowane widma absorpcji i emisji jednej z próbek i wyznaczyć przesunięcie Sokesa.


18) Po skończonych zajęciach zlać wszystkie próbki do odpowiedniego kontenera lub umieścić w lodówce zależnie od wskazań osoby prowadzącej.

Ad. B. Badanie izolowanych barwników fotsyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu).
1) Rozpuścić minimalną ilość chlorofilu a (nabranego za pomocą igły)

a) w 2 ml 80% wodnego roztworu acetonu,

b) w 2 ml metanolu.

2) Przygotować roztwory chlorofilu b i beta-karotenu podobnie jak w p. 1.

3) Zmierzyć widma absorpcji (380-750 nm) i rozcieńczyć odpowiednie próbki tymi samymi rozpuszczalnikami tak aby absorbancja pasma Qy chlorofili oraz absorbancja beta-karotenu w maksimum wynosiła ok. 1. Powtórzyć pomiary widm absorpcji. Zapisać je.

4) Zmierzyć

a) widma emisji emisji chlorofili

- w zakresie 420-750 nm przy wzbudzeniu ok. 400 nm – chlorofil a,

- w zakresie 500-750 nm przy wzbudzeniu ok. 480 nm – chlorofil b;

b) widmo emisji beta-karotenu po wzbudzeniu w maksimum absorpcji w zakresie od ~ 500 do 750 nm;

c) widma wzbudzenia chlorofilu a i b w zakresie od 380 nm do długości fali odpowiadającej wyraźnemu narastaniu pasma emisji.

5) Porównać i przedyskutować widma absorpcji, emisji i wzbudzenia

- dla różnych próbek,

- dla różnych rozpuszczalników,

oraz określić przesunięcia Stokesa.

6) Porównać i przedyskutować otrzymane wyniki z wynikami dla ekstraktów z liści.

7) Po skończonych zajęciach zlać wszystkie próbki do odpowiedniego kontenera lub umieścić w lodówce zależnie od wskazań osoby prowadzącej.
Ad. C. Badanie chloroplastów szpinaku (ewentualnie innych roślin)
IZOLACJA CHLOROPLASTÓW

1) Sprawdzić czy są przygotowane roztwory A i B (opisane w p. 2 i 3). Jeśli tak, przejść do punktu 4.

2) Sporządzić 500 ml roztworu A (0,4M sorbitolu z 0,01M NaCl).

3) Rozlać roztwór do dwóch zlewek po 250 ml. Do jednej ze zlewek dosypać 0,02M tris, celem przygotowania roztworu B (buforu homogenizującego).

4) Odważyć 15-20 g pietruszki lub liści rzodkiewki

5) Wrzucić liście do miksera jednocześnie dodając 50 ml roztworu B. Miksować kilkakrotnie przez 5 s. Unikać podgrzania liści.

6) Przesączyć zawiesinę przez warstwę gazy, następnie rozlać do probówek i wirować z prędkością 1400 lub 2000 rpm przez ok. 1 min.

7) Zlać supernatant do świeżej probówki. Zwirować ponownie z prędkością 10 000 rpm przez 5 minut.

8) Supernatant wylać, a pelet rozpuścić w 3 ml roztworu A.
POMIARY SPEKTROSKOPOWE I ICH ANALIZA

9) Rozcieńczyć małą ilość próbki roztworem A tak, aby otrzymać 2 ml roztworu o absorbancji ok. 1-1.5 Wykonać pomiary widma absorpcji.

10) Wykonać pomiary widm emisji i wzbudzenia analogiczne do tych przeprowadzonych na izolowanych barwnikach i wyekstrahowanej mieszaninie.

11) Porównać i przedyskutować uzyskane widma z tymi otrzymanymi dla izolowanych barwników i wyekstrahowanej mieszaniny.

12) Wyciągnąć wnioski co do transferu energii wzbudzenia elektronowego pomiędzy barwnikami w białkach fotosyntetycznych chloroplastów.

Materiały i sprzęt:

A. Liście szpinaku (może być mrożony) i dwóch innych roślin

Alkohol metylowy, aceton, woda destylowana

Gaza, bibuła, folia aluminiowa, rękawiczki gumowe

Moździeż, lejek, cylinder miarowy 25 lub 50 ml, 10 zlewek 30-100 ml, pipeta automatyczna 1-ml, strzykawka (preferowana szklana, do acetonu), filtry Millipore ~<1 μm (odporne na aceton, akohol metylowy)

Szklana kuwetka do pomiarów spektrofotometrycznych, 1 cm x 1 cm

Spektrofotometr UV-VIS, spektrofluorymetr, wirówka, waga

Kontener na roztwory organiczne

B. - dodatkowo:

Chlorofil a, chlorofil b, beta-karoten

Igły do strzykawki,

C. - dodatkowo:

20-30 g świeżych liści szpinaku, pietruszki, rzodkiewki lub ewentualnie innych roślin

Blender lub mikser



Zagadnienia do przygotowania:

1) Zjawiska absorpcji i fluorescencji. Prawo Lamberta-Beera. Widma absorpcji, emisji i wzbudzenia. Przesunięcie Stokesa.

2) Barwniki fotosyntetyczne (chlorofil a, chlorofil b oraz beta-karoten) – struktura, widma absorpcji i emisji, schematy poziomów energetycznych.

3) Proces fotosyntezy

- ogólne równanie fotosyntezy,

- budowa i funkcjonownie molekularnego aparatu fotosyntetycznego (chloroplasty, tylakoidy, błony fotosyntetyczne, fotosystem I, fotosystem II, cytochrom bc1, ATP-aza, przenoszenie energii i elektronów).

4) Zasada działania i schemat budowy spektrometru fluorescencyjnego i absorpcyjnego.
Literatura (dostępna w większości w bibliotece Wydz. Fizyki UAM):

1) R.E. Blankenship, Molecular mechanisms of photosynthesis, Blackwell Sciences, 2002.


2) J.M. Berg, L. Stryer, J.L. Tymoczko, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007.

(wersja internetowa, po angielsku, na: stronie: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/)


3) L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999. Str. 571-573.

4) W.W. Parson, Modern Optical Spectroscopy, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2007.

5) C.A. Villee, E.P. Solomon, L.R. Berg, Biologia, Multico, 2006.

Niezbędne zakupy (100 zł):

- moździerz – 100zł?


Wskazane zakupy wg ważności (~2100 zł brutto):

1) chlorofil a, 1 mg – 480 zł netto,

2) chlorofil b, 1 mg - 480 zł netto,

3) beta-karoten, 5 g – 290 zł netto,

4) blender ~50 zł,

5) sączki bibułowe ~50 zł.



6) fltry Millipore ~<1 mikrometr, odporne na aceton i metanol – 400 zł?






©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna