Związki azotowe niebiałkowe związki azotowe w surowicy



Pobieranie 102.32 Kb.
Data07.05.2016
Rozmiar102.32 Kb.
ZWIĄZKI AZOTOWE NIEBIAŁKOWE


Związki azotowe w surowicy

Azot całkowity osocza 1,2 g/dL (0,87 mol/L)



Azot białkowy Reszta azotowa

∼1,2 g/dL (0,86 mol/L) ∼ 20 mg/dL (14,2 mmol/L)

Azot resztkowy Azot mocznika

∼10 mg/dL (7 mmol/L) ∼10 mg/dL (7 mmol/L)

N aminokwasów ∼5 mg/dL (3,6 mmol/L)

N kwasu moczowego ∼1 mg/dL (0,71 mmol/L)

N kreatyniny ∼ 0,5 mg/dL (0,36 mmol/L)

N kreatyny ∼ 0,2 mg/dL (0,14 mmol/L)

N amoniaku ∼ 0,1 mg/dL (0,07 mmol/L)

N puryn, bilirubiny
Współczynniki pozwalające przeliczyć stężenie azotu na stężenie związku (uwzględnia masę cząsteczkową związku i liczbę atomów azotu w cząsteczce):


  • mocznik 2,14

  • kwas moczowy 3,0

  • kreatynina 3,12

  • kreatyna 3,12

  • amoniak 1,22

  • kwas hipurowy 12,79

  • białka osocza 6,54

Związki azotowe w moczu

Azot całkowity

16 g/24 h

Reszta azotowa Azot białkowy i mukoproteidy

16 g/24 g (0,16 mol/24 h) ∼ 100 mg/24 g (7,1 mmol/24 g)

(maksymalnie do 300 mg/24 h)


Azot resztkowy Azot mocznika

∼ 3g/24 g (0,21 mol/24 h) ∼ 13 g/24 h (0,92 mol/24 h)



N kreatyniny ∼ 0,6 g/24 h (40 mmol/24 h)

N amoniaku ∼ 0,5 g/24 h (36 mmoli/24 h)

N aminokwasów ∼ 0,5 g/24 h (36 mmoli/24 h)

N kwasu moczowego ∼ 0,2 g/24 h (14 mmoli/24 h)

N kwasu hipurowego ∼ 0,1 g/24 h (7 mmoli/24 h)

OZNACZANIE AZOTU POZABIAŁKOWEGO W POSTACI JONÓW AMONOWYCH

I Etap: odbiałczanie


  • ultrawirowanie

  • filtracja na żelach

  • za pomocą kwasów:

- sulfosalicylowego

- trójchlorooctowego (TCA)

- fosforowolframowego

II Etap: mineralizacja

III Etap: oznaczanie azotu w postaci jonu amonowego – metody


  • miareczkowe

  • gazometryczne

  • kolorymetryczne

  • enzymatyczne

  • potencjometryczne

METODA KJELDAHLA



  • jedna z najstarszych metod, ma znaczenie uniwersalne

  • bardzo duża czułość – można oznaczyć zawartość azotu rzędu 0,005-10 mg


Etapy:

  • mineralizacja – ogrzewanie ze stężonym H2SO4 w obecności CuSO4 (katalizator) powoduje utlenienie związków organicznych do związków nieorganicznych:

- N do NH3

- C, H, O, S do CO2, H2O, SO2



  • destylacja - NH3 wypiera się stężonym roztworem NaOH i oddestylowuje do odbieralnika zawierającego nasycony roztwór kwasu borowego – tworzy się boran amonowy (NH4)2B2O7

  • miareczkowanie - roztwór w odbieralniku miareczkujemy mianowanym roztworem HCl

METODY KOLORYMETRYCZNE



1. Metoda z odczynnikiem Nesslera

Odczynnik Nesslera = zasadowy roztwór K2[HgJ4] (tetrajodortęcianu (II) potasu) reaguje z jonami NH4+ dając żółte zabarwienie roztworu lub w większych ilościach wytrącając brunatny osad jodku tlenoaminortęciowego


Hg

O NH2 J

Hg


 (420 nm) = 3000 (mała czułość metody)
2. Metoda Berthelota

Jony amonowe reagują z podchlorynem sodu i fenolem (reakcja indofenolowa) w środowisku zasadowym (pH 10,5) – powstaje barwny związek absorbujący przy 614 nm (e = 20 000)

Metoda Berthelota:

- bardzo czuła i specyficzna

- przebiega wolno (dodatek nitroprusydku sodu przyspiesza reakcję)

METODA ENZYMATYCZNA

Z wykorzystaniem dehydrogenazy glutaminianowej (metoda referencyjna oznaczania azotu za pośrednictwem jonów amonowych)

GLDH


NH4+ + -ketoglutaran + NADH+H+ glutaminian + NAD+ +H2O
Test optyczny prosty

METODA POTENCJOMETRYCZNA

Metoda z użyciem elektrody jonoselektywnej – oznaczanie azotu bezpośrednio w postaci NH4+

AMINOKWASY


  • oznaczenia w surowicy, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym, płynie owodniowym

  • znaczenie:

- rozpoznanie wad wrodzonych w metabolizmie aminokwasów (np. fenyloketonuria)

- rozpoznanie zmian w kanalikach nerkowych

(aminoacyduria)

- diagnostyka w zespołach złego wchłaniania

- diagnostyka w kolagenozach (np. stężenie hydroksyproliny

w kolagenie)

- diagnostyka w chorobach, którym towarzyszą zaburzenia w metabolizmie

Aminokwasów


Zawartość niektórych aminokwasów w surowicy człowieka


Aminokwas

Stężenie

[mg/dL]

Aminokwas

Stężenie

[mg/dL]

Alanina

3,4

Ornityna

0,72

Arginina

1,5

Fenyloalanina

0,84

Kwas glutaminowy

0,70

Prolina

2,36

Cystyna

1,18

Seryna

1,12

Glicyna

1,5

Treonina

1,39

Histydyna

1,15

Tryptofan

1,11

Izoleucyna

0,89

Tyrozyna

1,03

Leucyna

1,69

Walina

2,88

Lizyna

2,72







Metionina

0,43







Charakterystyczny zapach moczu w niektórych wrodzonych wadach metabolicznych


Jednostka chorobowa

Zapach

Choroba syropu klonowego

Syropu klonowego/karmelu

Kwasica izowalerianowa

Spoconych stóp

Fenyloketonuria

Mysi

Trimetyloaminuria

Zepsutej ryby

Hipermetioninemia

Kapusty

OZNACZENIA JAKOŚCIOWE (PRZESIEWOWE)

1. Test z FeCl3 na obecność ketoaminokwasów w moczu


  • 1 mL moczu + 1 mL wodnego roztworu FeCl3 (75 g/L) i zakwasza się stężonym HCl do pH 3,0

  • wynik dodatni: zabarwienie moczu

  • zabarwienie znika w ciągu 5-15 minut (oznaczeń nie można wykonywać seryjnie)

2. Test z 2,4-dinitrofenylohydrazyną na obecność związków ketonowych w moczu

  • 1 mL moczu + 1 mL 2,4-dinitrofenylohydrazyny (2 g/L w 1 M HCl)

  • wynik dodatni: białe lub żółte zmętnienie w ciągu 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej

  • wyniki fałszywie dodatnie – obecność acetonu w moczu

3. Test z nitroprosydkiem sodu i cyjankiem sodu – na obecność cystyny i homocystyny w moczu



  • 4 mL moczu + 2 mL cyjanku sodu (50 mg/L) -> po inkubacji (10 minut w temperaturze pokojowej) dodajemy kroplami nitroprusydek sodu

  • wynik dodatni: czerwone zabarwienie

Testy barwne moczu (1)

Testy barwne moczu (2)

Testy barwne moczu (3)
OZNACZENIA ILOŚCIOWE

Metody:


  • chromatografia bibułowa aminokwasów w moczu (jedno- lub dwukierunkowa)

  • chromatografia cienkowarstwowa

  • elektrochromatografia

  • chromatografia jonowymienna

  • chromatografia gazowa

  • HPLC

  • metody kolorymetryczne

  • metody fluorymetryczne

  • spektrometria masowa

MOCZNIK

  • syntetyzowany w wątrobie i usuwany głównie przez nerki

  • swobodnie dyfunduje przez błony komórkowe

  • ok. 40% mocznika przesączonego w kłębuszkach nerkowych ulega

resorpcji zwrotnej, a także może być wydzielany w kanalikach nerkowych

  • stanowi ok. 45% azotu pozabiałkowego osocza

  • prawidłowe stężenie w surowicy (10-50 mg/dL) – zależy od:

- perfuzji nerek i wielkości diurezy (klirensu wolnej wody)

- wielkości GFR

- szybkości syntezy mocznika – zależy bezpośrednio od podaży

białka w diecie i katabolizmu białkowego



Nieprawidłowe stężenia mocznika

Obniżone stężenie mocznika w surowicy:

- zaburzenia syntezy mocznika (wyłączone 80-95%

miąższu wątroby)

- zmniejszona synteza w wątrobie z towarzyszącym

zwiększeniem objętości krwi krążącej (przewodnienie)

- stany anaboliczne (stosowanie androgenów)

- dieta niskobiałkowa

Zwiększone stężenie mocznika w surowicy:

- nadprodukcja mocznika (masywny rozpad białek tkankowych lub bogatobiałkowa

dieta, resorpcja białek po krwawieniu do przewodu pokarmowego, steroidoterapia,

nadczynność tarczycy)

- zmniejszenie perfuzji nerek

- odwodnienie

- terapia tetracyklinami
Wskazania do oznaczania mocznika w surowicy


  • różnicowanie przednerkowej i pozanerkowej azotemii (współczynnik mocznik/kreatynina)

  • nasilenie toksemii mocznicowej u chorych z terminalną niewydolnością nerek

  • u chorych dializowanych w celu oceny stanu metabolicznego i nasilenia katabolizmu białkowego

OZNACZANIE MOCZNIKA

Metoda chemiczna


  • oparta na reakcji Fearon’a, w której diacetyl kondensuje z mocznikiem tworząc barwną (żółtą) pochodną diazynową absorbującą przy 540 nm

  • diacetyl jest niestabilny – jest produkowany w środowisku reakcji z diacetymonoksymu w środowisku kwaśnym

  • ma ograniczoną swoistość (cytrulina i alantoina także dają reakcję dodatnią)

  • szybko następuje zmniejszenie natężenia barwy

  • reakcja przebiega w 100°C – okres ogrzewania zależy od stężenia mocznika

  • nie stosuje się do prawa Lamberta-Beera


Metoda enzymatyczna

  • metoda pośrednia – wykorzystuje ureazę hydrolizującą mocznik do CO2 i NH4+, który jest następnie oznaczany podczas reakcji Berthelota lub z dehydrogenazą glutaminianową (GLDH):

GLDH

NH4+ + -ketoglutaran + NADH+H+ glutaminian + NAD+ +H2O


Test optyczny prosty
Wartości referencyjne stężenia mocznika

(wyrażone jako azot mocznika BUN)



  • zdrowi dorośli: 6-20 mg/dL

  • dorośli powyżej 60 roku życia: 8-23 mg/dL

  • ciężarne i dzieci – lekko obniżone stężenia w stosunku do zdrowych dorosłych

  • nieco wyższe stężenia u mężczyzn niż u kobiet

!U pacjentów z nieleczoną przewlekła niewydolnością nerek może osiągać wartości 108-135 mg/dL!


Przelicznik BUN na stężenie mocznika: 0,46 (mg/dL) lub 2,14 (mmol/L)

Przelicznik mg/dL na mmol/L: 0,1665
AMONIAK

  • amoniak – źródła:

– z glutaminy, glutaminianu, alaniny transportowanych do przewodu pokarmowego,

wątroby i nerek

- syntetyzowany w przewodzie pokarmowym przy udziale flory bakteryjnej jelit


  • wbudowywany do mocznika w cyklu mocznikowym

  • przy fizjologicznym pH 7,4 amoniak występuje głównie w postaci zjonizowanej nie przechodzącej przez barierę krew-mózg. W przypadku zasadowicy wzrasta stężenie postaci niezjonizowanej, przechodzącej do mózgu i przez zwiększającej ryzyko wystąpienia encefalopatii

  • w nerkach amoniak uczestniczy w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej oraz wpływa na zasoby sodu i potasu w organizmie

OZNACZANIE AMONIAKU



Pobranie i przechowywanie materiału

- pacjent na czczo (ostatni posiłek co najmniej 6 godzin wcześniej), co najmniej 12

godzin bez papierosa

- osocze heparynizowane

- transport w lodzie

- pomiar 15-20 minut po pobraniu (jak najszybciej oddzielić osocze)

- próbka stabilna do 3 godzin w temperaturze 4°C i 24 godziny w

-20°C


- po zamrożeniu w -80°C poziom amoniaku nie zmienia się w

ciągu 7 dni

- podczas przechowywania w temperaturze pokojowej następuje

wzrost zawartości NH3 rzędu 0,02 mg/mL krwi/min (ok. 2%/min)


Metoda pośrednia – 2 etapy

Etap 1 - przeprowadzenie NH4+ w NH3:

- techniką dyfuzji izotermalnej

- przy użyciu żywic kationowymiennych (wymiana a następnie

elucja)

Etap 2 – oznaczenie NH4+



- metoda Nesslera

- metoda Berthelota

Metoda bezpośrednia – enzymatyczna

GLDH


NH4+ +-ketoglutaran + NADH+H+ glutaminian + NAD+ +H2O
Test optyczny prosty
Wartości referencyjne stężenia amoniaku

(wyrażone jako azot (N) w amoniaku)



  • noworodki : 64-107 mmol/L (90-150 mg N/dL)

  • niemowlęta: 21-50 mmol/L (29-70 mg N/dL)

  • dorośli: 15-45 mmol/L (11-32 mg N/dL)

Stężenie amoniaku w erytrocytach: 100-330 mg N/dL
Współczynnik przeliczeniowy z mmol/L na mg N/dL: 1,41

z mg N/dL na mmol/L: 0,714


Nieprawidłowe stężenia amoniaku

Zwiększone stężenie amoniaku we krwi

  • przyczyny wątrobowe:
    - marskość wątroby

- ostra niewydolność wątroby

- zapalenie wątroby

- zespół Reye’a

- wrodzone bloki enzymatyczne - zmniejszenie lub brak aktywności

enzymów cyklu mocznikowego


  • czynniki pozawątrobowe przy współistniejącym uszkodzeniu wątroby
     - znaczne obciążenie białkiem przewodu pokarmowego

- zakażenia
  - alkohol

- hipokaliemia


 - zasadowica metaboliczna

- zaburzone wydalanie nerkowe


KREATYNINA

OZNACZANIE KREATYNINY



Metody chemiczne

Reakcja Jaffego

Kreatynina reaguje z pikrynianem w środowisku alkalicznym tworząc pomarańczowo-czerwony związek kompleksowy (490-500 nm)


  • mało swoista reakcja – dodatnią reakcję Jaffego dają:

- kwas askorbinowy

- glukoza

- ciała ketonowe (interferują najsilniej – gł. acetooctan)

- białka


- pirogronian

Bilirubina interferuje ujemnie – dodanie surfaktantu i stosowanie buforów boranowego lub fosforanowego podczas reakcji, zmniejsza ten wpływ.


Zastosowanie pomiaru kinetycznego

Chromogeny niekreatyninowe:



  • reagujące bardzo szybko w ciągu 20 s po zmieszaniu reagentów i próbek (np. acetooctan)

  • reagujące pomiędzy 80-100 s po zmieszaniu (np. białka, glukoza)

  • kreatynina reaguje w okresie pomiędzy 30 i 90 s po zmieszaniu – mierzymy przyrost absorbancji

Usunięcie chromogenów niekreatyninowych – HPLC, dializa, chromatografia jonowymienna

Kreatynina reaguje z pikrynianem w wąskim zakresie pH 9,0-11,5

- inne związki różnie rozwijają barwę w zależności od pH

- powyżej pH rozwija się nieswoista barwa związana z glukozą, białkami, acetooctanem



Metody z odbiałczaniem (wynik zaniżony ok. 15%) i bez odbiałczania

Metody enzymatyczne

Wartości referencyjne stężenia kreatyniny

Zależne od zastosowanej metody – dla metody Jaffego:



  • mężczyźni: 0,9-1,3 mg/dL (80-115 mmol/L)

  • kobiety: 0,6-1,1 mg/dL (53-97 mmol/L)

U pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek leczonych zachowawczo:11 mg/dL (1000 mmol/L)


Współczynnik przeliczeniowy z mg/dL na mmol/L: 88,4

Wydalanie kreatyniny z moczem:



  • mężczyźni: 14-26 mg/kg/24 h (124-230 mmol/kg/24 h)

  • kobiety: 11-20 mg/kg/24 h (97-177 mmol/kg/24 h)

Nieprawidłowe stężenia kreatyniny

Zwiększone stężenie kreatyniny

  • prawidłowa funkcja nerek

- odwodnienie

- akromegalia



  • ostra niewydolność nerek

- przednerkowa (wstrząs hipowolemiczny, kardiogenny, septyczny,

anafilaktyczny)

- nerkowa (toksyczne/alergiczne działanie leków, środki cieniujące,

mioliza, hemoliza, szpiczak, metale ciężkie, posocznica, rzucawka

ciężarnych, choroby układowe, szybko postępujące kłębuszkowe

zapalenie nerek)

- pozanerkowa (zatrzymanie moczu, narkotyki)


  • przewlekła niewydolność nerek (kłębuszkowe zapalenie nerek, śródmiąższowe zapalenie nerek, nefropatia cukrzycowa, nadciśnienie tętnicze, choroby tkanki łącznej, nerka szpiczakowa)



KWAS MOCZOWY

  • główny produkt katabolizmu puryn

- puryny dostarczane z dietą (ok. 300 mg/24 h)

- katabolizm endogennych kwasów nukleinowych



  • synteza kwasu moczowego: ok. 400 mg/24 h

  • w nerkach kwas moczowy jest:

- filtrowany w kłębuszkach nerkowych

- w 98-100% resorbowany w cewkach proksymalnych krętych

- następnie wydzielany do światła kanalików w części dystalnej kanalików proksymalnych

- resorbowany w cewkach dystalnych


6-12% kwasu moczowego przefiltrowanego w kłębuszkach jest wydalone z moczem.
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO

Metoda chemiczna

Metoda z kwasem fosforowolframowym (PTA)



  • wykorzystuje właściwości redukujące kwasu moczowego

  • PTA w środowisku alkalicznym ulega redukcji pod wpływem kwasu moczowego – powstaje barwny związek (650-700 nm)

  • wiele substancji interferuje w tej reakcji


Metoda enzymatyczna

Metoda z urykazą

  • urykaza katalizuje utlenienie kwasu moczowego do alantoiny, czemu towarzyszy produkcja H2O2 i CO2

  • guanina, ksantyna i kilka innych analogów kwasu moczowego może interferować w tej reakcji (musiałyby występować w stężeniach nie spotykanych w próbkach biologicznych)

  • pomiar:

- w stanie równowagi (po zakończeniu inkubacji)

- pomiar kinetyczny – spadek absorbancji przy 293 nm


Metoda z urykazą sprzężona z układem peroksydazy

  • z użyciem jednego z wielu akceptorów tlenu i wytworzeniem barwnego chromogenu:

- 4-aminofenazon z substytutem fenolu = sulfonianem p-

hydroksybenzenowym (reakcja Trindera = peroksydaza/fenol/4-

aminoantypiryna) – 546 nm

- hydrazon 3-metylo-1-benzotiazoliny (MBTH)

- 2,2’-azyno-di(3-etylo-benzotiazolino)-6-siarczan (ABTS)

- o-dianizydyna



  • substancje interferujące

- kwas askorbinowy (dodaje się oksydazę askorbinianową)

- bilirubina (dodaje się ferrocyjanid)


Metoda z zastosowaniem HPLC

  • metoda referencyjna

  • chromatografia jonowymienna lub odwrotnej fazy (RP)

  • detektor spektrofotometryczny – 293 nm (detekcja kwasu moczowego w eluencie)

  • czas retencji dla kwasu moczowego: do 6 minut

Proponowana metoda definitywna oznaczania kwasu moczowego to metoda rozcieńczeń izotopowych sprzężona ze spektrometrią masową (ID-MS)
Wartości referencyjne stężenia kwasu moczowego

Dla metod enzymatycznych:

  • mężczyźni: 3,5-7,2 mg/dL (0,208-0,428 mmol/L)

  • kobiety: 2,6-6,0 mg/dL (0,155-0,357 mmol/L)

  • stężenie kwasu moczowego

- zwiększa się wraz z wiekiem – ok. 10% pomiędzy 20 i 60 rokiem życia

- zwiększa się u kobiet po menopauzie (osiągają stężenia takie jak u mężczyzn)

- w ciąży stężenie kwasu moczowego zmniejsza się w ciągu pierwszego trymestru i utrzymuje się do 24 tygodnia ciąży, kiedy zaczyna się zwiększać nawet do poziomu wyższego niż przed ciążą

Współczynnik przeliczeniowy z mg/dL na mmol/L: 0,06


  • wydalanie z moczem:

- u osób na diecie zawierającej puryny 250-750 mg/24 h (1,5-4,5 mmol/24 h)

– dieta bez puryn: 20-25% mniejsze wydalanie kwasu moczowego z moczem



Współczynnik przeliczeniowy z mg/24 h na mmol/24 h: 0,006

Nieprawidłowe stężenia kwasu moczowego



Hipourykemie (stężenie kwasu moczowego w surowicy < 2 mg/dL)

  • leki

- allopurinol (inhibitor oksydazy ksantynowej) – przedawkowanie

- salicylany

- estrogeny

- fenylobutazon



  • radiologiczne środki cieniujące

  • niewydolność wątroby

  • tubulopatie (zmniejszona resorpcja)

Hiperurykemie (stężenie kwasu moczowego >7 mg/dL u mężczyzn i >6 mg/dL u kobiet) - spowodowane zwiększoną syntezą kwasu moczowego

  • pierwotne

- idiopatyczne

- dziedziczne choroby metaboliczne



  • wtórne

- zbyt duża podaż z dietą

- nasilony obrót metaboliczny puryn np. w białaczkach, szpiczaku,

w czasie radioterapii, chemioterapii, urazach)

- łuszczyca

- zmieniony metabolizm ATP

- stan przedrzucawkowy

- niedotlenienie tkanek

- alkohol



Hiperurykemie (stężenie kwasu moczowego - spowodowane zmniejszonym wydalaniem kwasu moczowego

  • pierwotne

- idiopatyczne

  • wtórne

- ostre i przewlekłe choroby nerek

- zwiększona resorpcja w nerkach

- zmniejszone wydzielanie w nerkach

- zatrucie ołowiem

- stan przedrzucawkowy

- kwasy organiczne (mlekowy, acetooctowy)

- salicylany (niewielkie dawki)

- diuretyki tiazydowe



- zespół Downa




©absta.pl 2016
wyślij wiadomość

    Strona główna