Część wstępna pracy magisterskiej pani Kamilli Bronisz wykonanej pod kierunkiem prof. Adama Patkowskiego



Pobieranie 105.38 Kb.
Data06.05.2016
Rozmiar105.38 Kb.
Część wstępna pracy magisterskiej
pani Kamilli Bronisz
wykonanej pod kierunkiem prof. Adama Patkowskiego

Poznań 2003



1. Wstęp

Tematem mojej pracy magisterskiej jest „Badanie struktury i dynamiki polielektrolitów przy pomocy spektroskopii korelacji fluorescencji i dynamicznego rozpraszania światła”. Badania przeprowadzone zostały przy pomocy spektrometru ConfoCor2, który od stycznia 2001 r. jest dostępny w Zakładzie Biofizyki Molekularnej.

W pierwszej części pracy omówione zostało zjawisko fluorescencji, następnie przedstawiono podstawy teoretyczne oraz biofizyczne pomiarów wykorzystujących zjawisko fluorescencji, kolejny rozdział zawiera opis jednej z metod pomiaru fluorescencji - spektroskopię korelacji fluorescencji, część ostatnia zawiera wyniki badań.

Spektroskopia korelacji fluorescencji jest jedną z metod, która pozwala na analizę próbek o bardzo niskim stężeniu. W odróżnieniu od innych metod fluorescencyjnych w spektroskopii korelacji fluorescencji uwaga skupiona jest nie na natężeniu emisji własnej fluorescencji, ale raczej na spontanicznych fluktuacjach natężenia fluorescencji znakowanych barwnikami obiektów, spowodowanych przez niewielkie fluktuacje liczby cząstek w objętości czynnej. Poniższy poglądowy rysunek prezentuje zasadę przeprowadzania pomiaru przy pomocy SKF





Rys. 1.1. Zasada przeprowadzania pomiarów przy pomocy SKF.


Od lewej przedstawiony jest kształt objętości czynnej (objętości konfokalnej), następnie cząstki znakowane barwnikiem fluoryzującym znajdujące się w tejże objętości i emitujące fotony fluorescencji. Czasowy zanik fluktuacji natężenia sygnału fluorescencji jest opisywany przy pomocy funkcji korelacji fluorescencji omówionej szczegółowo w rozdziale 3.
W technikach dynamicznego rozpraszania światła dynamikę badanych próbek odzwierciedlają fluktuacje natężenia światła rozproszonego. Stosunkowo niewielka wydajność zjawiska rozpraszania oraz jego powszechność powodują, że techniki rozproszeniowe wymagają stosunkowo dużych objętości i stężenia preparatu. W zastosowaniach biochemicznych np. w wyznaczaniu konformacji nowopoznanych białek, takie ilości preparatu są wręcz nieosiągalne, co często kończy współpracę specjalistów z dziedziny rozpraszania światła z pracowniami biochemicznymi.

Od wady tej wolna jest spektroskopia korelacji fluorescencji, w której dzięki użyciu mikroskopu konfokalnego objętość oświetlana promieniem lasera maleje do pojedynczych femtolitrów, a wymagane stężenie jest rzędu nanomola. Tę wspaniałą wydajność zapewnia zjawisko fluorescencji, które dodatkowo wprowadza bardzo dobrą selektywność mierzonego sygnału. W tradycyjnych badaniach rozproszeniowych często spora część mierzonego sygnału pochodzi od różnego rodzaju zanieczyszczeń obecnych w kuwetce pomiarowej pomimo usilnych prób starannego oczyszczenia preparatu. W spektroskopii korelacji fluorescencji widać wyłącznie znakowane cząsteczki, co eliminuje konieczność oczyszczania preparatu.

Technika spektroskopii korelacji fluorescencji pozwala na badanie procesów asocjacji, przede wszystkim w odniesieniu do ważnych cząsteczek biologicznych (receptory białkowe, fragmenty DNA), oraz badanie własności fizykochemicznych ośrodków z otoczenia lub wnętrza żywej komórki. Dzięki dobrej lokalizacji pomiaru można mierzyć ruchliwość cząsteczek w określonych miejscach wewnątrz komórki lub wewnątrz różnego rodzaju tkanek.

Głównym przeznaczeniem spektrometru ConfoCor2 jest pomiar ruchliwości cząsteczek znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi (lub samych barwników) w dobrze zdefiniowanym, niewielkim obszarze o wymiarach rzędu jednego mikrometra. Jako wynik otrzymuje się bezwzględną wartość współczynnika dyfuzji translacyjnej w przestrzeni 3- wymiarowej lub 2- wymiarowej np na powierzchni błony lipidowej lub cienkiej warstwy.

Pomimo, iż pomiary przy pomocy SKF nie dają tak dokładnych pomiarów współczynnika dyfuzji translacyjnej jak tradycyjne pomiary rozproszeniowe, w zamian jednak za to technika ta oferuje możliwości pomiarów wielkości bardzo trudno mierzalnych innymi metodami. Pozwala ona m in. na pomiary


  • specyficzności nowych leków,

  • reakcji enzymatycznych, w których enzym i substrat tworzą kompleksy,

  • reakcji wiązania się białek do kwasów nukleinowych,

  • reakcji wiązania komplementarnych fragmentów DNA (możliwość stwierdzenia chorób genetycznych),

  • reakcji wiązania różnego rodzaju cząsteczek do receptorów komórkowych (testy alergiczne) [4].

Najistotniejszym zjawiskiem z punktu widzenia spektroskopii korelacji fluorescencji jest, jak sama nazwa mówi, fluorescencja. Kolejny rozdział przybliży podstawy tego procesu.


2. Luminescencja.
2.1. Podział luminescencji.
Świecenie ciał ogrzanych do wysokich temperatur nazywamy emisją ciał rozżarzonych. Wszystkie inne rodzaje promieniowania nazywamy luminescencją [8]. Polega więc ona na świeceniu nietermicznym, a bodźcami pobudzającymi do zimnego świecenia mogą być światło, energia elektryczna, chemiczna, energia powstająca przy rozkładzie radioaktywnych pierwiastków jak również energia mechaniczna. Ciała podatne na występowanie w nich zjawiska luminescencji noszą ogólnie nazwę luminoforów. W zależności od energii bodźca wyróżniamy odpowiednio: elektroluminescencję, chemiluminescencję, radioluminescencję, mechanoluminescencję oraz fotoluminescencję. Schematyczny podział luminescencji pokazuje poniższy rysunek.

Rys. 2.1. Podział luminescencji.

Elektroluminescencja jest świeceniem ciał pobudzonych energią elektryczną np. świecenie lampy jarzeniowej lub lasera półprzewodnikowego. Zjawisko to w pierwszym przypadku wywołane jest działaniem prądu elektrycznego przechodzącego przez zjonizowany gaz, w drugim powstaje w wyniku przejścia prądu elektrycznego przez półprzewodnik.

Z często obserwowanych przykładów można wymienić katodoluminescencję, czyli świecenie gazów rozrzedzonych w czasie przepływu przez nie prądu elektrycznego (neony). W laboratoriach medycznych spotykamy się z elektroluminescencją w postaci świecenia ekranów różnego rodzaju lamp oscyloskopowych, na których dokonuje się obserwacji przebiegu potencjałów bioelektrycznych (ekg, eeg i podobne). Ekrany te, podobnie jak ekran telewizora pokryte są od wewnątrz substancją fluoryzującą pod wpływem padających na nią elektronów.

Chemiluminescencja występuje w czasie reakcji chemicznych związanych najczęściej z utlenianiem. Pewną odmianę chemiluminescencji stanowi bioluminescencja, polegająca na świeceniu pewnych narządów różnych zwierząt (robaczki świętojańskie, „fosforescencja” mórz i oceanów). Osobną odmianą chemiluminescencji jest termoluminescencja. Pojawia się ona w przypadku, gdy w trakcie ogrzewania zamrożonej substancji zachodzą reakcje chemiczne między reaktywnymi cząstkami. Tryboluminescencję obserwujemy w trakcie kruszenia niektórych ciał stałych, które emitują światło w wyniku powstawania statycznych ładunków elektrycznych, wytworzonych przez tarcie, a sonoluminescencję – w wyniku działania silnych fal dźwiękowych.

Luminescencja występuje tak w ciałach stałych, jak i cieczach i gazach. W zależności od złożoności procesu emisji światła wyróżniamy dwa typy fotoluminescencji – fluorescencję i fosforescencję. Fluorescencja zachodzi, gdy elektron przechodzi bezpośrednio ze stanu wzbudzonego do stanu o niższej energii. Fosforescencja jest procesem bardziej złożonym. W tym przypadku wzbudzony atom lub cząsteczka nim przejdzie do stanu podstawowego, znajdzie się w stanie metatrwałym o czasie życia dłuższym niż 10-8s. Opóźniona fluorescencja, która zanika znacznie wolniej niż zwykła, „szybka” fluorescencja tej samej cząsteczki, pojawia się w wyniku kilku różnych mechanizmów, z których najlepiej poznanymi są: anihilacja tryplet- tryplet i termicznie aktywowana fluorescencja opóźniona [6].

Czas wygaszania fluorescencji jest zazwyczaj krótszy niż fosforescencji i często służy, (choć nie jest to zbyt ścisłe) za postawę do odróżnienia obu tych zjawisk. Czas życia fluorescencji może się zawierać w granicach od ns do kilku dni [8]. W związku z tym, iż fluorescencja jest zjawiskiem niezwykle rozpowszechnionym w badaniach spektroskopowych zostanie ona szczegółowo przeanalizowana w kolejnym podrozdziale.

W zjawisku fotoluminescencji słuszna jest na ogół reguła Stokesa, która głosi, że długość fali p światła pobudzającego ciało do świecenia powinna być mniejsza od długości fali e światła luminescencji. Jeśli energia fotonu pobudzającego Ep= hp, a energia fotonu emitowanego podczas luminescencji Ee=he, to he= hp-W, stąd wynika, że p< e. Dzieje się tak dlatego, ponieważ część energii (W), jaką atom lub cząsteczka uzyskały podczas wzbudzenia, zostaje w zderzeniach przekazana innym cząsteczkom (tzw. przejścia bezpromieniste).




2.2. Fluorescencja.
Często można stwierdzić, zwłaszcza w przypadku dużych i sztywnych układów w fazach skondensowanych, że widma fluorescencji, wykreślone w skali częstości (energii), stanowią w przybliżeniu lustrzane odbicia widm absorpcji (rys. 2.3, 2.4). Zważywszy, że w temperaturze pokojowej absorpcja zachodzi z poziomu S0(0) stanu podstawowego, a emisja, na skutek bardzo szybkiej relaksacji oscylacyjnej – z poziomu S1(0) stanu wzbudzonego, istnienie symetrii zwierciadlanej sugeruje duże podobieństwo różnic energii pomiędzy poziomami oscylacyjnymi w obu stanach elektronowych.

K
ażdy układ fizyczny dąży do stanu, w którym jego energia przyjmuje wartość minimalną, czyli do stanu równowagi. Wyobraźmy sobie molekułę, która zaabsorbowała energię, będzie ona dążyła do jej oddania, a tym samym do osiągnięcia stanu równowagi termicznej, czyli do osiągnięcia temperatury jednakowej w każdym elemencie objętości układu. Obsadzenie poziomów energetycznych możemy opisać przy pomocy funkcji rozkładu energii Boltzmanna:

Rys. 2.2. Obsadzenie poziomów energetycznych w molekule. Funkcja rozkładu energii Boltzmanna [1].
nw/ nn oznacza stosunek liczby molekuł na wyższym poziomie energetycznym Ew i niższym En, czyli stosunek obsadzeń energetycznych w temperaturze T, k – stała Boltzmanna =1.38*10-23 J*K-1.

Dwa podstawowe mechanizmy pozbywania się zaabsorbowanej energii to bezpromieniste (konwersja wewnętrzna, przejścia interkombinacyjne) i promieniste (fluorescencja, fluorescencja opóźniona, fosforescencja) przekazywanie energii otoczeniu . Pierwsze z nich odbywa się w zderzeniach (zbliżeniach) molekuł, ponieważ średnia energia, rzędu kT, jest zbliżona do odstępów poziomów energetycznych rotacyjnych i oscylacyjnych, drugie zaś polega na emisji fotonu.

Molekularno-kinetyczna teoria gazów pozwala określić czas pomiędzy zderzeniami molekuł. W gazie o małych molekułach pod ciśnieniem atmosferycznym czas ten wynosi 10-10 sekundy. W cieczach sens zderzeń, raczej zbliżeń, jest mniej jasny, ale oceniono, że czas między zderzeniami molekuł wynosi 10-13 sekundy.

Energia rotacyjna jest bardzo łatwo przekazywana w zderzeniach i prawie wszystkie zderzenia są efektywne. Częstości rotacji są rzędu 1011 – 1012 s-1 , czyli w gazie w ciągu 10*9-10 s między kolejnymi zderzeniami molekuła zdąży wykonać 10-100 obrotów, a w cieczy w ciągu 10-13 s nie zdąży wykonać między zderzeniami ani jednego obrotu.

Energia oscylacyjna nie jest w zderzeniach tak łatwo przekazywana jak energia rotacyjna. Ocenia się, że na dziesięć tysięcy zderzeń jedno jest efektywne. W takim zderzeniu energia oscylacyjna przekształca się w energię rotacyjną i translacyjną obu zderzających się molekuł. Wynika z tego, że czas życia na wzbudzonym poziomie oscylacyjnym jest rzędu 10-9 sekundy. Częstości oscylacji są rzędu 1013 – 1014 s-1, a więc w czasie 10-9 s molekuła zdąży wykonać bardzo wiele drgań.

Dlatego to widma oscylacyjne można obserwować w cieczach, natomiast widma rotacyjne i oscylacyjno-rotacyjne obserwujemy tylko w gazach.

Energia wzbudzenia elektronowego jest zbyt duża, aby molekuła mogła się jej w tak łatwy bezpromienisty sposób pozbyć w zakresie niewysokich temperatur. Dominuje więc mechanizm promienisty i molekuła po pewnym czasie życia na elektronowym poziomie wzbudzonym emituje pochłonięty foton. To zjawisko, jak już wcześniej wspomniano, nazywamy luminescencją.

Najważniejsze dla spektroskopii wzbudzenie elektronowe spowodowane absorpcją promieniowania elektromagnetycznego jest przyczyną emisji zwanej fluorescencją. Na rys. 2.3. pokazano najprostszy przypadek absorpcji i emisji elektronowej – fluorescencji.




Rys. 2.3. Krzywe energii potencjalnej stanów elektronowych podstawowego i wzbudzonego oraz przejścia emisyjne i absorpcyjne.

Przed absorpcją prawie wszystkie molekuły w temperaturze pokojowej znajdują się na zerowym poziomie oscylacyjnym podstawowego poziomu elektronowego. Po pochłonięciu fotonu molekuły mogą się znaleźć na którymś z poziomów oscylacyjnych wzbudzonego poziomu elektronowego. Przejście elektronowe jest bardzo szybkie, trwa ok. 10-15 s, okres oscylacji jest natomiast rzędu 10-13 s; skąd wywiedziono regułę Francka– Condona, w myśl, której w czasie przejścia elektronowego nie zdąży się zmienić odległość r między zrębami atomowymi lub innymi słowy, ponieważ jądra są znacznie cięższe od elektronów, przejścia elektronowe zachodzą znacznie szybciej, niż jądra są w stanie na nie zareagować [16]. Dlatego też strzałki oznaczające przejścia elektronowe przebiegają pionowo na rys.2.3. Mogą się one kończyć na różnych poziomach oscylacyjnych elektronowych stanów wzbudzonych. Pasmo absorpcyjne powinno mieć strukturę oscylacyjną, której składowe odzwierciedlają odstępy poziomów oscylacyjnych na wzbudzonym poziomie elektronowym. Powrót do podstawowego stanu elektronowego jest utrudniony i molekuła „żyje” przez pewien czas we wzbudzonym stanie elektronowym. W tym czasie oddaje w sposób bezpromienisty w zderzeniach nadmiar energii oscylacyjnej i schodzi do zerowego poziomu oscylacyjnego na wzbudzonym poziomie elektronowym. Ze wzbudzonego poziomu wraca do podstawowego poziomu elektronowego w sposób promienisty, przy czym może się zatrzymać na różnych poziomach oscylacyjnych podstawowego poziomu elektronowego. Pasmo fluorescencji powinno więc również mieć strukturę oscylacyjną, ale odległości składowych będą odzwierciedlać tym razem odstępy poziomów oscylacyjnych na elektronowym poziomie podstawowym.

Zwraca uwagę fakt, że strzałki przejść fluorescencyjnych są krótsze niż strzałki przejść absorpcyjnych, z wyjątkiem strzałek przejścia między oscylacyjnymi poziomami 0-0, które są sobie równe. Oznacza to, że pasmo fluorescencji leży w obszarze niższych częstości (dłuższych fal) niż pasmo absorpcyjne. Stąd wywodzi się reguła Stokesa, w myśl której długości fali promieniowania fluorescencyjnego są większe od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję lub co najwyżej im równe[1].

Z powyższych rozważań wynika, iż widma fluorescencji, wykreślone w skali częstości (energii), stanowią w przybliżeniu lustrzane odbicia widm absorpcji. Doświadczenia wykazały, że rzeczywiście tak jest zwłaszcza w przypadku dużych i sztywnych układów sztywnych fazach skondensowanych (rys.2.4, 2.5).


Rys.2.4. Schemat układu wzajemnych położeń pasm absorpcji, fluorescencji i fosforescencji.





Rys. 2.5. Widmo absorpcji i widmo fluorescencji fenyloalaniny [2].

Na rys.2.3 przedstawiono modelowe widma absorpcji i emisji elektronowej natomiast przykładowe widmo absorpcji i fluorescencji fenyloalaniny na rys. 2.4. Energia fotonów fosforescencji jest niższa od energii fotonów fluorescencji, a ta z kolei jest niższa od energii zaabsorbowanych fotonów. Z tego względu widma te są przesunięte względem siebie. Ponadto widmo absorpcyjne jest bardziej strome po stronie fal dłuższych, natomiast widma fluorescencji i fosforescencji po stronie fal krótszych. Poza tym, jak już wcześniej wspomniano, widma absorpcji i fluorescencji są swoimi zwierciadlanymi odbiciami. Sposób powstawania jednego i drugiego widma pozwala to wytłumaczyć, jeżeli uwzględni się fakt, że poziomy energii oscylacyjnej w miarę jej wzrostu zagęszczają się (rys. 2.6.).

R
ys. 2.6. Przejścia w cząsteczce przy absorpcji fotonów i przy fluorescencji [2].


2.3 Diagram Jabłońskiego.

Aleksander Jabłoński wybitny polski fizyk jest twórcą schematu przejść elektronowych, który w literaturze światowej nosi nazwę schematu (diagramu) Jabłońskiego. Diagram ten idealnie odzwierciedla procesy zachodzące w molekule po zaabsorbowaniu energii (rys.2.7).




Rys. 2.7. Schemat Jabłońskiego. Poziomy energii elektronowej: S0, S1 – singletowe, T1 – tripletowe; 0, 1, 2, 3 – poziomy energii oscylacyjnej; a1, a2 – absorpcja fotonów; F – fluorescencja, Ph – fosforescencja; IC( internal conversion) – przejścia bezpromieniste, ISC (inter system crossing) – przejścia międzysystemowe [2].

Schemat poziomów Jabłońskiego stanowi uproszczony układ kilku najniższych stanów elektronowych i oscylacyjnych, w jakich może znaleźć się molekuła. Zaznaczone są na nim stany elektronowe cząsteczki (poziomy energii elektronowej): singletowe (S0, S1) i trypletowe (T1) oraz związane z nimi poziomy energii oscylacyjnej (oznaczone cyframi). Stan podstawowy- S0, w którym energia elektronowa jest najmniejsza, jest prawie zawsze stanem singletowym, a przejścia singlet- tryplet, czyli z odwróceniem spinu są zabronione. Poziomów energii rotacyjnej (leżącej pomiędzy poziomami energii oscylacyjnej) nie zaznaczono – dla przejrzystości rysunku, a także, dlatego że nie są one istotne przy wyjaśnianiu interesujących nas zjawisk fizycznych. W stanach singletowych (S) wypadkowy spin wszystkich elektronów w cząsteczce jest równy 0 (multipletowość 2S+1=1), natomiast w stanach trypletowych (T) (może być ich więcej, a nie tylko zaznaczony na schemacie T1; uwaga ta dotyczy także stanów S) jest on równy 1 (2S+1=3). Znaczy to, że w stanach S w cząsteczce wszystkie elektrony mają skompensowane (sparowane) spiny(↑↓), a w stanach T jedna para elektronów ma spiny zgodnie skierowane(↑↑). W temp. pokojowej, w warunkach równowagi termodynamicznej większość molekuł zajmować będzie najniższy poziom oscylacyjny stanu podstawowego S0. Na rys. 2.6. zaznaczony został końcowy efekt przejść do tegoż stanu, do którego z wyższych stanów oscylacyjnych prowadzą przejścia bezpromieniste. Molekuły, znajdujące się w stanie podstawowym, są w stanie zaabsorbować kwant światła o energii nie mniejszej niż energetyczny odstęp S0 – S1. W wyniku absorpcji w ciągu ok. 10-15 s, molekuła przechodzi ze stanu S0(0) do wzbudzonego stanu oscylacyjnego jednego z wyższych stanów elektronowych Sn na najniższy poziom energii oscylacyjnej (przejście a1) lub, przy wyższej energii zaabsorbowanego fotonu, może to być przejście na któryś z wyższych poziomów oscylacyjnych (przejście a2) [2]. Trzeba teraz postawić sobie zasadnicze pytanie: co może się dziać z cząsteczką znajdującą się w stanie wzbudzonym singletowym, np. S1? W przypadku gdy przeszła ona do stanu S1 o wyższej energii oscylacyjnej (po pochłonięciu fotonu o energii hν2 – przejście do stanu S1(2))– nadmiaru energii oscylacyjnej pozbywa się na drodze bezpromienistej (przekazuje ją do otoczenia jako ciepło) przez przejście IC (konwersję wewnętrzną), obrazowane strzałką falistą. W stanie wzbudzonym S1(0) (o najniższej energii oscylacyjnej) cząsteczka przebywa ok.10-8s, potem mogą zachodzić następujące alternatywne zjawiska:

a) przejście S1- rożne podpoziomy oscylacyjne stanu podstawowego S0, mówimy wówczas o fluorescencji (F), przy czym energia wypromieniowanego fotonu hf jest mniejsza od energii zaabsorbowanego fotonu. W niektórych przypadkach (np. proste cząstki) zdarza się, że energia wypromieniowanego fotonu jest równa energii fotonu zaabsorbowanego. Mówimy wówczas o fluorescencji rezonansowej,

b) przejście S1- wysokie stany oscylacyjne stanu S0- mówimy wówczas o konwersji wewnętrznej (przejścia bezpromieniste). Oznacza to, że cząsteczka przekazuje energię do otoczenia w postaci ciepła, w zderzeniach z innymi cząstkami. Proces ten nazywamy również dezaktywacją bezpromienistą cząsteczki lub relaksacja oscylacyjną.

c) przejście S1- układ stanów trypletowych tzw. przejście międzysystemowe (ISC). Jest to proces bardzo wolny, gdyż musi mu towarzyszyć zabronione odwrócenie spinu elektronu. Obecność ciężkich atomów, mogących silnym polem elektrycznym ułatwić odwrócenie spinu, zwiększa prawdopodobieństwo tego przejścia .Cząsteczka w stanie T1 charakteryzuje się dłuższym niż 10-8s czasem życia, w niektórych przypadkach dochodzącym do kilku sekund. Molekuła znajdująca się w stanie trypletowym T1 może przejść do stanu podstawowego S0 na drodze fosforescencji (Ph)(T1- S0), emitując kwant hνPh, oczywiście najpierw bezpromieniście (IC) musi przejść do poziomu T1. W rzadkich przypadkach gdy stany T1 i S1 leżą blisko siebie, molekuła może, w wyniku wzbudzenia termicznego, powrócić do stanu S1, mówimy wówczas o fluorescencji opóźnionej.

Warto zastanowić się również nad wpływem temperatury na zjawisko fluorescencji. Natężenie fluorescencji zmniejsza się często ze wzrostem temperatury. Sugeruje to istnienie jakiejś bariery energetycznej [zazwyczaj 4-40 kJ*mol-1 (1-10 kcal*mol-1)]. Ponieważ przyjmuje się, że emisja nie zależy od temperatury, bariera energetyczna jest przypuszczalnie związana z konkurencyjnym procesem bezpromienistym. Wydaje się, iż procesem tym jest przejście interkombinacyjne [9] z S1 do wyższego stanu trypletowego. Rola temperatury polega na zwiększeniu obsadzenia wyższych oscylacyjnych i rotacyjnych podpoziomów S1, z których przejście interkombinacyjne może zachodzić szybciej. W miarę wzrostu temperatury rośnie więc szybkość przejścia interkombinacyjnego, a zatem mniej cząsteczek w stanie S1 może wyeliminować światło i natężenie fluorescencji maleje.

Należy również zauważyć, iż jeżeli wzbudzone cząstki ulegają dezaktywacji tylko przez emisję fluorescencji, to natężenie jej, wynoszące z chwilą przerwania wzbudzenia I0, maleje z upływem czasu wykładniczo, zgodnie z równaniem:



(2.1)

gdzie: kf—odpowiada współczynnikowi Einsteina emisji samorzutnej

0= 1/ kf—naturalny średni czas życia cząstek w stanie wzbudzonym1

t—czas trwania wzbudzenia.

Czas życia fluorescencji można w przybliżeniu obliczyć posługując się następującym równaniem:



(2.2)

gdzie: oznacza częstość średnią pasma absorpcji w cm-1



-oznaczony eksperymentalnie współczynnik absorpcji scałkowany po całym paśmie absorpcji.

W przypadku pasma symetrycznego równanie to można zapisać w postaci:



, (2.3)

gdzie: - maksymalny współczynnik absorpcji danego pasma absorpcji



- szerokość połówkowa pasma absorpcji (cm-1).
Jeżeli mniej kwantów zastaje wyemitowanych niż zaabsorbowanych mówimy o „wygaszaniu” luminescencji. Wygaszanie to może być częściowo lub całkowicie przypisane działaniu czynników wewnętrznych (procesy bezpromieniste prowadzące do stanu podstawowego) lub zewnętrznych (oddziaływanie cząsteczek wzbudzonych z innymi cząsteczkami).

Wydajność kwantową fluorescencji znajduje się określając całkowitą liczbę fotonów emitowanych przez cząsteczkę wysyłającą promieniowanie fluorescencyjne w całym zakresie widma fluorescencji i porównując tę liczbę z liczbą absorbowanych fotonów o danej częstości:



, (2.4)
gdzie: - wydajność kwantowa fluorescencji

- całkowite natężenie fluorescencji

- natężenie absorbowanego światła.



3. Podstawy teoretyczne.
3.1. Funkcja korelacji.
Rozpoczynając teoretyczne rozważania na temat funkcji autokorelacji warto zauważyć, iż próbki stosowane w badaniach biochemicznych są utrzymywane w stanie równowagi termodynamicznej . Wszystkie więc analizowane procesy są statystycznymi fluktuacjami w pobliżu punktu równowagi. Z procesami tymi związane są współczynniki kinetyczne, takie jak współczynnik dyfuzji czy stałe szybkości reakcji chemicznych, określające dynamikę ich relaksacji, która z kolei określa kształt funkcji zwanej funkcją autokorelacji G(t). W zasadzie kinetyczne współczynniki wszystkich procesów przyczyniają się do zaniku G(t), tak więc każdy z tych procesów może być określony z tejże funkcji.

Rozważmy na początku idealny roztwór m składników. Wszystkie one biorą udział w dyfuzji i reakcjach chemicznych. Scharakteryzujmy każdy ze składników j poprzez jego lokalne stężenie , jego średnią po rozkładzie cząstek przez , a lokalne fluktuacje stężenia przez. W pobliżu stanu równowagi nieliniowe równanie chemiczne może zostać zlinearyzowane i wówczas równanie relaksacji dla fluktuacji może zostać zapisane jako:



, (3.1)

gdzie pierwszy człon określa dyfuzję, drugi opisuje zmiany chemiczne, a współczynniki Kjk są związane ze stałymi szybkości reakcji chemicznych i stężeniem równowagowym próbki.

Rozkład wzbudzającego światła w próbce jest oznaczmy przez . Zakładamy, że liczba fotonów emitowanych oraz zbieranych z każdej molekuły jest proporcjonalna do , tak więc ilość zebranych fotonów przypadająca na czas próbkowania dana jest przez:

(3.2)

gdzie jest iloczynem przekroju czynnego na absorpcję przez wydajność kwantową fluorescencji i wydajności fluorescencji dla komponentu k. Zdefiniujmy średnią ilość fotonów jako wówczas fluktuację ilości fotonów od średniej możemy zapisać jako:



. (3.3)

Z punktu widzenia eksperymentu FCS ważna jest funkcja autokorelacji G(t), może być ona zdefiniowana jako średnia po rozkładzie cząstek następująco:

. (3.4)

Podstawiając (3.3) do (3.4) otrzymujemy:



.(3.5)

Zatem funkcja autokorelacji natężenia fluktuacji jest splotem funkcji autokorelacji oraz funkcji korelacji krzyżowej2 fluktuacji stężenia wzbudzonego obszaru

Korzystając z faktu, że są rozwiązaniami równania (3.1) z początkowym warunkiem możemy wyrazić średnią poprzez kombinację korelacji w chwili zero . Korelacja ta może być wyznaczona pod warunkiem, że mamy do czynienia z idealnym roztworem tzn. takim, gdzie długość korelacji jest znacznie mniejsza niż odległość między molekułami. Położenie różnych molekuł tego samego rodzaju, a także te różnych rodzajów, wzajemnie nie korelują ze sobą:
. (3.6)

Przykładową analizę tego równania prowadzącą do wyprowadzenia funkcji autokorelacji można prześledzić w pozycji [11].

Funkcja G(t) może zostać wyznaczona korzystając z parametrów układu eksperymentalnego oraz ze współczynnika dyfuzji, stałych szybkości reakcji oraz koncentracji chemicznych składników w próbce.

W wielu zastosowaniach FCS-u konfokalny układ optyczny jest używany w taki sposób, że funkcja autokorelacji może być bezpośrednio wyznaczona przez zastosowanie gaussowskiego profilu natężenia oświetlenia:



, (3.7)

gdzie i oznaczają rozmiar wiązki w objętości konfokalnej w kierunku propagacji światła, prostopadle do płaszczyzn wyznaczonych przez współrzędne x, y, z (w warunkach normalnych ).

Tak więc transformata Fouriera profilu wiązki padającej dana jest przez:

(3.8)

Zastanówmy się, jaką postać przyjmie funkcja autokorelacji w najprostszym przypadku- rozcieńczonego roztworu zawierającego jeden składnik? Równanie (3.1) zawiera element związany z dyfuzją pojedynczego elementu (pomijając indeksy dolne):



,

gdzie D jest współczynnikiem dyfuzji cząstki.

Powyższe równanie może być w łatwy sposób rozwiązane korzystając z transformaty Fouriera:
.

Oznaczając średnią liczbę molekuł w objętości próbki jako oraz wskaźnik objętości konfokalnej jako otrzymujemy:



, (3.9)

gdzie jest efektywną objętością próbki oraz i są odpowiednio charakterystycznymi czasami dyfuzji wzdłuż i wszerz oświetlanego obszaru. Daje to ostatecznie zależność:


. (3.10)

Jak mogliśmy przypuszczać amplituda funkcji korelacji jest odwrotnie proporcjonalna do średniej liczby molekuł znajdujących się w mierzonej objętości, ponieważ fluktuacje w tejże objętości są odwrotnie proporcjonalne do oraz G(t) jest funkcją drugiego rzędu natężenia fluktuacji.

Zauważając, że w równaniach (3.9) i (3.10) każdy z kierunków ruchu translacyjnego zawiera element więc dla dwuwymiarowej dyfuzji w płaszczyźnie x y mamy:

. (3.11)

W praktyce (3.11) jest także dobrym przybliżeniem dla układu trójwymiarowego przy zachowaniu warunku, że , tak więc relaksacja fluktuacji liczby molekuł w mierzonej objętości jest określana przez współczynnik dyfuzji w mniejszym wymiarze.

Tak więc stężenie i współczynnik dyfuzji cząstek fluoryzujących może być wyznaczony przy pomocy równań (3.10) i (3.11) z pomiarów G(t), wielkość mierzonej objętości jest wyznaczana przy pomocy innego eksperymentu.

3.2. Teoretyczne podstawy obliczania czasu dyfuzji, objętość konfokalna.


Czas dyfuzji molekuły jest definiowany poprzez współczynnik dyfuzji D, który silnie zależy od następujących parametrów:

  • pośrednio masy molekularnej molekuły,

  • ogólnego kształtu molekuły.

W poniższych rozważaniach przyjmijmy, że badanym obiektem są sferyczne (kuliste) molekuły. Współczynnik dyfuzji definiujemy w sposób następujący:

, (3.12)

gdzie: k- stała Boltzmana T- temperatura

- lepkość r- hydrodynamiczny promień molekuły.

Promień hydrodynamiczny jest to promień modelowej kulki, która ma taki sam współczynnik dyfuzji jak badana molekuła i może być on wyliczony używając następującego równania:


, (3.13)

gdzie: m- masa molekularna molekuły

- liczba Avogadro=

- średnia gęstość molekuły.
Na podstawie czasu dyfuzji, mierzonego przy użyciu techniki FCS, oraz znanego współczynnika dyfuzji można wyliczyć średnicę wiązki laserowej w następujący sposób:

stąd , (3.14)

gdzie: - czas dyfuzji molekuły

D- współczynnik dyfuzji (dla Rh6G= ).

oznacza średnicę wiązki laserowej jeśli element objętości konfokalnej przybliżymy walcem co pokazuje rys.3.2.


Rys 3.1. Kształt elementu objętości konfokalnej.




Rys. 3.2. Objętość konfokalna jako walec.


Długość walca może zostać wyliczona znając parametr struktury (z ang. axis ratio,structure parameter), wyznaczony z dopasowania krzywej korelacji, a będący, jak już wcześniej wspomniano stosunkiem , w sposób następujący:

(3.15)

Znając oraz objętość elementu konfokalnego może być oszacowana z zależności:



(3.16)

Jeżeli znamy objętość elementu konfokalnego możemy wyliczyć stężenie fluoryzujących cząstek korzystając z równania:



, (3.17)

gdzie N jest liczbą cząstek w objętości konfokalnej wyznaczoną z dopasowania krzywej korelacji (z ang. number of particles).

3.3. Funkcja korelacji dla określonej geometrii układu.
Dla tak zdefiniowanej geometrii funkcja korelacji przyjmuje następującą postać:

, (3.18)
gdzie: N- całkowita liczba molekuł w objętości konfokalnej

- czas dyfuzji spełniający dodatkowo założenie

T- frakcja N molekuł w stanie trypletowym , która ma typowy czas życia .

Sumowanie odbywa się po wszystkich procesach mających miejsce podczas pomiaru.

Poniższy rysunki pokazują przykładowe funkcje korelacji.





Kolorem niebieskim zaznaczona jest krzywa doświadczalna, zielonym krzywa teoretyczna natomiast czerwonym kanał od którego rozpoczęte zostało dopasowywanie Dolne wykresy przedstawiają różnice w nałożeniu się obu krzywych.(residua krzywej doświadczalnej)






Kolorem czerwonym zaznaczona jest krzywa doświadczalna oraz kanał od którego rozpoczęte zostało dopasowywanie (linia podłużna), natomiast zielonym krzywa teoretyczna Dolne wykresy przedstawiają różnice w nałożeniu się obu krzywych.(residua krzywej doświadczalnej)



4. Aparatura pomiarowa.
4.1 Standardowa geometria układu konfokalnego.
Jak wynika z teoretycznych rozważań, pomiary metodą spektroskopii korelacji fluorescencji wymagają małych objętości próbki (zapewniając małą liczbę molekuł i stąd wysoką amplitudę funkcji korelacji), a także wysokiej skuteczności detekcji fotonów i dobrego odrzucania tła fluorescencji. Wymagania te spełnia, jak zauważył Rigler i jego współpracownicy (1992/1993), projekt konfokalnego oświetlenia, który przedstawia poniższy rysunek.



Rys. 4.1. Schemat standardowego układu konfokalnego. Objaśnienia: S- próbka, OB- obiektyw, L- soczewka, DM- zwierciadło dichroiczne, NT- filtr wycinający, T- soczewka, PH- pinhol, BS- pryzmat światłodzielący , APD- dioda lawinowa, CORR.- korelator [11].



W układzie konfokalnym (rys 4.1) wzbudzona wiązka laserowa jest kierowana na obiektyw następnie na soczewkę i dalej przez układ luster dichroicznych na obiektyw o dużej apreturze numerycznej, który ogniskuje ją wewnątrz próbki. Fotony emitowane na skutek fluorescencji są gromadzone przez ten sam obiektyw i ogniskowane na pinholu. Dodatkowo przestrzenne filtry, efektywnie obcinają próbkowaną objętość do dyfrakcyjnie ograniczonych rozmiarów. Następnie sygnał fluorescencji może być gromadzony bezpośrednio przez detektor liczący fotony i przetwarzany w funkcję korelacji.


1 tu czas życia fluorescencji niekiedy nazywany też promienistym czasem życia


2 badanie obiektów znakowanych dwoma różnymi barwnikami (Schwille 1997).





©absta.pl 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna