Insulinopodobny czynnik wzrostowy-i w ślinie doniesienie wstępne



Pobieranie 44.2 Kb.
Data07.05.2016
Rozmiar44.2 Kb.
Insulinopodobny czynnik wzrostowy-I w ślinie - doniesienie wstępne

Insulin-like growth factor I in saliva- preliminary communication


Ewelina Taudul, Małgorzata Wolańska

Zakład Biochemii Lekarskiej Uniwersytet Medyczny w Białymstoku,

15-089 Białystok, ul. Mickiewicza 2c

zdbioch@umwb.edu.pl

tel./fax 0857485578

Kierownik: prof. dr hab. Edward Bańkowski
Autor do korespondencji: dr hab. Małgorzata Wolańska

Zakład Biochemii Lekarskiej Uniwersytet Medyczny w Białymstoku,

15-089 Białystok, ul. Mickiewicza 2c

ma.wolanska@interia.pl

tel. 857485610, fax 0857485578

Streszczenie
Wprowadzenie: Wśród wielu białek obecnych w ślinie znajdują się peptydowe czynniki wzrostowe, do których zaliczamy między innymi IGF-I i IGF-II. Są one polipeptydami o masie cząsteczkowej 7,5 kDa. W osoczu krążą w postaci kompleksów z białkami wiążącymi-BP (binding proteins). Głównym białkiem wiążącym IGF w osoczu jest BP-3. Kompleksy tych czynników z białkami (IGFBP-3) wiążącymi regulują ich biodostępność oraz modyfikują efekty działania.

Cel pracy: Celem pracy było wykazanie w ślinie, pochodzącej od zdrowych osób w różnych przedziałach wiekowych, obecności IGF oraz białek wiążących ten czynnik.

Materiał i metody: Materiał do badań stanowiła spoczynkowa ślina mieszana, otrzymywana od ogólnie zdrowych ochotników pobierana metodą wypluwania. Badaniem objęto 70 osób w wieku 5-75 lat, których podzielono na 7 grup uwzględniających wiek i płeć. Do oceny IGF-I i białek wiążących IGFBP-3 zastosowano metody elektroforetyczne i Western immunoblot.

Wyniki: Wynik elektroforezy wykazuje, iż w ślinie dominują białka o masie cząsteczkowej powyżej 54 kDa. Prawdopodobnie są to albuminy, nie zaobserwowano znaczących różnic w elektroforegramach poszczególnych, badanych grup. Western immunoblot białek wiążących BP-3 uwidocznia wybarwione pasma odpowiadające masie cząsteczkowej około 35 kDa. Powyższej masie cząsteczkowej odpowiada masa cząsteczkowa kompleksu białka wiążącego BP-3 z IGF-I. Nie zaobserwowano obecności IGF-I w postaci wolnej.

Wnioski: Nasze wstępne badania wykazały, że IGF-I występuje w ślinie w postaci kompleksów z białkami wiążącymi, a jego ekspresja nie zależy od płci i wieku.
Hasła indeksowe: ślina, insulinopodobny czynnik wzrostowy-I, białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostowy 3.

Summary


Introduction: There are many proteins, including peptide growth factors, present in saliva. Among them probably the insulin- like growth factors can be found. IGF-I and IGF-II are polypeptides of the molecular mass of 7.5 kDa. They circulate as complexes with binding proteins in plasma. The main IGF binding protein is BP-3 in plasma. Complexes of those growth factors with binding proteins (IGFBP-3) regulate their bioavailability and modify effects of their action.

The aim of the study: The aim of the study was to detect of IGF and IGF binding proteins in saliva of healthy persons of different age.

Material and methods: Material for the study was non-stimulated mixed saliva taken with the spiting out method from generally healthy volunteers. The 70 persons aged 5-75 were divided into 7 groups taking into account age and sex. For determination of IGF-I and IGFBP-3 electrophoretic method and Western immunoblot technique were used.

Results: The electrophoretic pattern indicates that proteins with molecular mass above 54 kDa are present in the saliva. They are probably albumins. There are not significant differences in electrophoregrams of investigated groups. Western immunoblot results for IGFBP-3 show bands of the molecular mass of about 35 kDa. They could correspond to the complex of binding protein BP-3 with IGF-I. Free form of IGF-I is not observed.

Conclusions: Our preliminary results indicate that IGF-I is present in the saliva in a form of complexes with binding proteins. Its expression does not depend on sex and age.

Key words: saliva, insulin-like growth factor I, insulin-like growth factor binding protein 3.

Wstęp
W ostatnich latach w ślinie wykryto obecność ponad 1000 różnych białek, których ocena, jak się wydaje, w przyszłości ułatwi diagnostykę wielu chorób metabolicznych czy nowotworowych. Białka te w większości występują w bardzo małych ilościach, co powoduje, że w chwili obecnej są niedostępne do badań klasycznymi metodami pomiaru zawartości białek [6,9].

Wśród wielu białek obecnych w ślinie występują peptydowe czynniki wzrostowe. Odgrywają one doniosłą rolę w utrzymaniu prawidłowej homeostazy jamy ustnej. Znana jest rola czynnika wzrostowego naskórka (EGF), transformującego czynnika wzrostowego (TGF) czy czynników wzrostowych fibroblastów (FGF). Do chwili obecnej kontrowersje budzi obecność w ślinie insulinopodobnych czynników wzrostowych (IGF) [1,4,8,16].

Te ostatnie, znane powszechnie jako IGF-I i IGF-II są polipeptydami o masie cząsteczkowej 7,5 kDa. W osoczu krążą w postaci kompleksów z białkami wiążącymi-BP (binding proteins). Głównym białkiem wiążącym IGF w osoczu jest BP-3. Kompleksy tych czynników z białkami wiążącymi (IGFBP-3) regulują ich biodostępność oraz modyfikują efekty działania. IGF-I jest postrzegany jako podstawowy czynnik pobudzający procesy wzrostu i procesy regeneracyjne w uszkodzonych tkankach. Jest silnym stymulatorem podziałów fibroblastów oraz biosyntezy kolagenu. Należy założyć, że może odgrywać również ważną rolę w biologii jamy ustnej [12,14].

Celem pracy było wykazanie w ślinie, pochodzącej od zdrowych osób w różnych przedziałach wiekowych, obecności IGF oraz białek wiążących ten czynnik.


Materiał i metody
Materiał do badań stanowiła spoczynkowa ślina mieszana, otrzymywana od ogólnie zdrowych ochotników, którą pobierano metodą wypluwania. Badaniem objęto 70 osób w wieku 5-75 lat, których podzielono na 7 grup uwzględniających wiek i płeć.

I - dzieci (5-10 lat),

II - kobiety (20-30 lat),

III - mężczyźni (20-30 lat),

IV - kobiety (40-50 lat),

V - mężczyźni (40-50 lat),

VI - kobiety (> 50 lat),

VII - mężczyźni (> 50 lat).

Do każdej grupy zakwalifikowano 10 osób. Na przeprowadzone badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku.

Ślinę pobierano w godzinach porannych (pomiędzy 8.00- 9.00), na czczo, około 1 - 2 godzin po umyciu zębów i dokładnym wypłukaniu jamy ustnej wodą.

W celu oddzielenia zanieczyszczeń oraz złuszczających się komórek pochodzących z błony śluzowej jamy ustnej pobrany materiał wstępnie odwirowywano z prędkością 4000 obrotów/min przez 10 min w temperaturze pokojowej. Następnie uzyskany nadsącz poddawano trzykrotnej 15- sekundowej homogenizacji za pomocą ultradźwięków (20 kHz). Materiał ponownie odwirowywano w takich samych warunkach, a uzyskany nadsącz porcjowano i do czasu oznaczeń przechowywano w temperaturze -20°C.

Ocena elektroforetyczna białek śliny

Nasącz uzyskany po homogenizacji śliny (5 μl) poddawano elektroforezie na 10% żelu poliakryloamidowym w 0,0625M buforze fosforanowym, pH 6,8, zawierającym 20% glicerol oraz 3% siarczan dodecylosodowy – SDS, przy natężeniu prądu 30 mA metodą opisaną przez Laemmli [10]. Żele barwiono 0,125% roztworem „Coomassie Brillant Blue” R-250, a następnie odbarwiano mieszaniną kwasu octowego:izopropanolu:wody, w relacji 2:5:13 (v:v:v).
Western immunoblot IGFBP-3 i IGF-I

Nasącz uzyskany po homogenizacji śliny (5 μl) poddawano elektroforezie na 10% żelu poliakryloamidowym, metodą opisaną przez Laemmli [10]. Używano białkowych standardów mas cząsteczkowych Bio-Rad, USA.

Po zakończeniu elektroforezy, żel pozostawiano przez 5 minut w mieszaninie zawierającej 0,025M Tris i 0,2M glicynę w 20% metanolu (v/v). Transfer białek na błonę nitrocelulozową (o wielkości porów 0,2m) prowadzono przy natężeniu prądu 100mA w ciągu 1 godziny, za pomocą aparatu SIGMA – SU 20-SDB. Błonę barwiono 0,2% roztworem Panceau S przez 1 min., a następnie odbarwiano roztworem TBS-T o następującym składzie: 0,02M bufor Tris-HCl o pH 7,4, zawierającym 0,15M NaCl oraz 0,05% Tween 20. W celu uniemożliwienia powstania niespecyficznych wiązań pomiędzy przeciwciałem a nitrocelulozą, błonę poddawano działaniu 5% roztworu odtłuszczonego, suchego mleka w TBS-T przez 1 godzinę, w   temperaturze pokojowej z okresowym delikatnym mieszaniem. Następnie błony nitrocelulozowe inkubowano ze specyficznymi przeciwciałami. Jako pierwsze stosowano monoklonalne przeciwciało (miano 1: 5000) przeciwko białkom wiążącym IGFBP-3 (Sigma). Jako drugie, stosowano przeciwciało (miano 1: 5 000) przeciwko mysiej IgG (Sigma), sprzężone z fosfatazą alkaliczną [5].

Podobne procedury stosowano w przypadku oceny IGF-I (R&D). Dodatkowo eksperyment przeprowadzono w warunkach pozbawionych redukcji β-merkaptoetanolem.

Efektem tego postępowania było pojawienie się prążków barwy intensywnie niebieskiej, odpowiadających badanym białkom wiążącym czy czynnikowi wzrostowemu.
Wyniki
Wyniki badań jakościowych, wykonywanych techniką elektroforezy i Western immunoblot, przedstawiono w postaci elektroforegramów i immunoblotów, reprezentatywnych dla poszczególnych badanych grup.
Rozdziały elektroforetyczne wykazują obecność w ślinie wybarwionych pasm odpowiadających białkom o różnych masach cząsteczkowych. Wynik elektroforezy przedstawia rycina 1. Jak wynika z ryciny dominują białka o masie cząsteczkowej powyżej 54 kDa. Prawdopodobnie są to albuminy, których masa cząsteczkowa wynosi około 66 kDa. Nie zaobserwowano znaczących różnic w elektroforegramach poszczególnych, badanych grup.

ryc.1
Wyniki Western immunoblot białek wiążących BP-3 przedstawia rycina 2. Widoczne są wybarwione pasma odpowiadające masie cząsteczkowej około 35 kDa. Powyższej masie cząsteczkowej odpowiada masa cząsteczkowa kompleksu białka wiążącego BP-3 z IGF-I.

ryc.2
Rycina 3A i 3B przedstawia próbę wykrycia obecności IGF-I w ślinie.

Rycina 3A przedstawia wyniki blotingu w warunkach pozbawionych redukcji. Na wszystkich ścieżkach widoczne jest pojedyncze pasmo o dużych masach cząsteczkowych. Wynik ten może sugerować, że IGF-I pozostaje w kompleksach, słabo penetrujących w głąb żelu. Rycina 3B przedstawia wyniki blotingu w warunkach redukcji β-merkaptoetanolem. Użycie czynnika redukującego skutkuje pojawieniem się pasm o mniejszych masach cząsteczkowych. Prawdopodobnie IGF-I występuje w kompleksach z białkami wiążącymi. Widoczne jest wyraźne pasmo odpowiadające masie cząsteczkowej kompleksu białka wiążącego BP-3 z IGF-1. Nie zaobserwowano jednak obecności tego czynnika w postaci wolnej, którego masa cząsteczkowa wynosi około 7kDa. Powyższy wynik potwierdza obecność białek wiążących IGF. Na powyższej rycinie występują pasma o większej masie cząsteczkowej – prawdopodobnie są to kompleksy IGF z innymi białkami wiążącymi, do których należy białko ALS.

ryc.3 A i B
Omówienie wyników i dyskusja
Ślina jest płynem biologicznym, w którym mogą znajdować odzwierciedlenie różne stany chorobowe. Jest materiałem łatwo dostępnym, ale obecnie nie w pełni docenianym w diagnostyce [6,9].

Rozwój biologii molekularnej umożliwił stosowanie nowych metod pomiarów białek w ślinie, których zmiany zawartości w przyszłości mogą być uważane za markery wielu patologii, przede wszystkim chorób nowotworowych i metabolicznych. W chwili obecnej wykrywa się w ślinie różne aktywne biologicznie peptydy, do których należą między innymi czynniki wzrostowe. Są syntetyzowane i wydzielane przez gruczoły ślinowe. Należą do nich dobrze scharakteryzowane EGF, TNF i TGF-α. Czynniki te biorą udział w procesach regeneracyjnych czy resorbcyjnych [8,11,13,15,16].

Nieliczne doniesienia wskazują na obecność w ślinie insulinopodobnych czynników wzrostowych - IGF-I i IGF-II. Po raz pierwszy czynniki te wykazano u pacjentów z akromegalią czy dobrze rozwiniętą masą mięśniową [1,4,11].

Insulinopodobne czynniki wzrostowe, zwane też somatomedynami, należą do grupy peptydów odznaczających się strukturalnym podobieństwem do proinsuliny. W osoczu IGF występuje w formie wolnej lub związanej ze specyficznymi białkami. Opisano sześć białek wiążących ten czynnik wzrostowe, oznaczając je symbolami od IGFBP-1 do IGFBP-6. Ponad 90% krążącego IGF-I związane jest z IGFBP-3 oraz innym białkiem kompleksującym, którym jest kwasowo labilna cząsteczka - ALS (acid labil subunit), o masie cząsteczkowej około 85 kDa. Finalny kompleks wykazuje wówczas masę czasteczkową około 150 kDa. Pozostawanie IGF w kompleksach przedłuża czas półtrwania IGF-I, jest rezerwuarem tego czynnika. W tkankach dominuje kompleks niezawierający białka ALS. Uwolnienie IGF-I z kompleksu następuje po uprzedniej proteolizie IGFBP, przy udziale specyficznych proteaz. Prawdopodobnie tylko mniej niż 1% tego czynnika występuje w postaci wolnej, który ma zdolność do wiązania się ze specyficznym receptorem- IGF-IR. Receptor jest tetrametrem zbudowanym z dwóch zewnątrzkomórkowych podjednostek α oraz dwóch śródbłonowych β, o aktywności kinazy tyrozynowej. Po połączeniu z ligandem dochodzi do fosforylacji białka IRS-1 zwanego substratem receptora insuliny i uruchamiana jest kaskada reakcji cząsteczek sygnałowych, co w efekcie doprowadza do transkrypcji określonych genów [2,3,7,13].

Również białka wiążące IGF (IGFBP) zdolne są do wiązania z receptorami IGF, co może prowadzić do zmiany powinowactwa IGF do komórki. Powinowactwo białek wiążących do IGF jest jednak wyższe niż do receptorów, dlatego mogą one blokować oddziaływanie pomiędzy IGF i IGF-IR oraz hamować działanie tych czynników [7,16].

Ze względu na fakt, iż specyfika działania licznych hormonów, zwłaszcza jajników i nadnerczy różna jest w zależności od płci i wieku, a jednocześnie hormony te obok innych czynników mogą wpływać na zawartość IGF, jak i białek wiążących, badanych pacjentów podzieliliśmy na grupy uwzględniając wiek i płeć [7,12]. Nasze badania wykazały obecność w ślinie we wszystkich badanych grupach IGFBP-3. Lokalizacja na immunoblotach wskazuje, że białka te występują w kompleksach w powiązaniu z IGF-I. Wskazuje na to masa cząsteczkowa około 35 kDa, co odpowiada sumarycznej masie cząsteczkowej IGF-I i IGFBP-3. Nie wykazaliśmy istotnych różnic w ekspresji badanego białka w badanych grupach. Zapewne efekt wpływu wielu hormonów czy cytokin na badane czynniki znajduje odzwierciedlenie w osoczu czy tkankach, a nie dotyczy śliny.


Powyższe spostrzeżenia potwierdza analiza immunoblotów, z zastosowaniem przeciwciał przeciwko IGF-I. Również wykazaliśmy obecność pasm o masie cząsteczkowej około 35 kDa, co wskazuje, że czynnik ten występuje w kompleksach z białkami wiążącymi. W badanych grupach nie wykazaliśmy obecności wolnego, endogennego IGF-I. Powyższy eksperyment potwierdza, iż czynnik ten w ślinie, podobnie jak w innych płynach i tkankach, występuje w wielkocząsteczkowych kompleksach. Wyniki blotingu w warunkach pozbawionych redukcji wykazały obecność pojedynczego pasma o dużych masach cząsteczkowych. Wynik ten może sugerować, że IGF-I pozostaje w kompleksach słabo penetrujących w głąb żelu. Użycie czynnika redukującego skutkuje pojawieniem się pasm o mniejszych masach cząsteczkowych.
Wnioski
Nasze wstępne badania wykazały, że IGF-I występuje w ślinie w postaci kompleksów z białkami wiążącymi, a jego ekspresja nie zależy od płci i wieku.

Piśmiennictwo


1. Antonelli G., Cappellin E., Gatti R., Chiappin S., Spinella P., De Palo E. F.: Measurement of free IGF-I saliva levels: Perspectives in the detection of GH/IGF axis in athletes. Clin Biochem 2007, 40, 8: 545-550.

2. Boisclair Y. R., Rhoads R. P., Ueki I., Wang J., Ooi G. T.: The acis-labile subunit (ALS) of the 150 kDa IGF-binding protein complex: an important but forgotten component of the circulating IGF system. J Endocrinol 2001, 170: 63-70.

3. Burchardt P., Goździcka-Józefiak A., Siminiak T.: IGF-1 – nowy czynnik ryzyka miażdżycy naczyń wieńcowych? Kardiol Pol 2006, 64: 1297-1302.

4. Costigan D. C., Guyda J. H., Posner I. B.: Free Insulin-Like Growth Factor I (IGF-I) and IGF-II in Human Saliva. J Clin Endocrinol Metab 1988, 66, 5: 1014-1018.

5. Hosenlopp P., Seurin D., Segowia-Quinson B. et al.: Analysis of serum insulin-like growth factor binding proteins using Western blotting: use of the method for titration of the binding proteins and competitive binding studies. Anal Biochem 1986, 154: 138-143.

6. Jach M., Gońda M., Lisiecka K., Bober J., Mokrzycka M., Kuczak M.: Wykorzystanie wybranych badań fizykochemicznych śliny w diagnostyce stomatologicznej – na podstawie piśmiennictwa. Czas Stomatol 2008, 61, 5: 353-358.

7. Józefiak A., Pacholska J., Kędzia W.: Rola IGF-I i IGFBP w procesie neogenezy. Perinat Neonat Ginek 2008, 1, 3: 175-183.

8. Kaczmarek U., Sołtan E., Paradowski L., Waśko-Czopnik D., Grzesiak-Gasek I.: Stężenie naskórkowego czynnika wzrostu w ślinie chorych na chorobę refluksową przełyku. Dent. Med. Probl. 2006, 43, 4: 535-540.

9. Król K., Grocholewicz K.: Wybrane białka śliny jako biomarkery miejscowych i ogólnych procesów chorobowych. Przegląd piśmiennictwa. Ann Acad Med Stein 2007, 53, 1: 78-82.

10. Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227: 680-685.

11. Shpitzer T., Bahar G., Feinmesser R., Nagler R. M.: A comprehensive salivary analysis for oral cancer diagnosis. J Cancer Res Clin Oncol 2007, 133: 613-617.

12. Szewczuk M., Zych S., Czerniawska-Piątkowska E.: Ewolucja poglądów na temat insulinopodobnych czynników wzrostu. Postepy Biochem 2009, 55(3): 329-336.

13. Werner H., Katz J.: The Emerging Role of the Insulin-like Growth Factors in Oral Biology. J Dent Res 2004, 83(11): 832-836.

14. Wędrychowicz A., Dziatkowiak H., Sztefko K., Nazim J.: Zachowanie się IGF-1 i jego białek wiążących IGFBP-1 i IGFBP-3 u dzieci i młodzieży chorych na cukrzycę typu 1 oraz ich zależność od kontroli metabolicznej cukrzycy. Diabet Dośw Klin 2003, 3, 6: 489-499.

15. Wilczyńska-Borawska M., Stokowska W., Myśliwiec M.: Nowe czynniki wzrostowe w ślinie chorych z przewlekłą niewydolnością nerek. Mag Stomat 2008, 1: 40-43.

16. Zelles T., Purushotham K. R., Macauley S. P., Oxford G. E., Humphreys-Beher M. G.: Saliva and Growth Factors: The Fountain of Youth Resides in Us All. J Dent Res 1995, 74(12): 1826-1832.

Ryciny

Ryc.1


Ryc. 2

Ryc. 3A

Ryc. 3B


Opisy rycin
Ryc. 1 Rozdział elektroforetyczny białek śliny. Po lewej stronie zaznaczono pozycję standardu mas cząsteczkowych.

Ryc. 2 Western immunoblot wskazujący na ekspresję białek wiążących (IGFBP-3). Po lewej stronie zaznaczono pozycję standardu mas cząsteczkowych.



Ryc. 3A Western immunoblot wskazujący na ekspresję IGF-I w warunkach pozbawionych redukcji. Po lewej stronie zaznaczono pozycję standardu mas cząsteczkowych.

Ryc. 3B Western immunoblot wskazujący na ekspresję IGF-I w warunkach redukcji. Po lewej stronie zaznaczono pozycję standardu mas cząsteczkowych.




©absta.pl 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna