Metody elektroforetyczne. Elektroforeza białek surowicy krwi w żelu agarozowym

Elektroforeza białek polega na ich rozdziale na różnego typu podłożach w polu elektrycznym. Rozdział elektroforetyczny białek surowicy na żelu agarozowym pozwala na uzyskanie sześciu frakcji białek surowicy: albuminy, _-globuliny, ₂-globuliny, ₁-globuliny, ₂-globuliny, -globuliny. Każda z frakcji zawiera liczne białka indywidualne.

Zasilacz, aplikator próbek, komora do elektroforezy, pojemniki, zbiorniki do inkubacji, uchwyty do żeli, suszarka, cylindry miarowe, kolby miarowe, pipety automatyczne, bibuła cienka, ramka do przenoszenia płytek

• 
  żel agarozowy
  
• 
  bufor Tris-barbitalowy (pH 8,5)
  
• 
  rozcieńczalnik barwnika
  
• 
  barwnik – czerń amidowa
  
• 
  roztwór odbarwiający
  

1. 
   Przygotowanie próbek
   

• 
  próbki surowicy po rozmrożeniu powinny być dokładnie wymieszane
  

2. 
   Migracja
   

• 
  do każdej z części komory do elektroforezy nalać po 150 mL buforu Tris-barbitalowego
  
• 
  ustawić urządzenie aplikujące na płaskiej powierzchni, a nastepnie podnieść ramię z nadrukowanymi liczbami
  
• 
  na powierzchnię z nadrukowaną ramką nanieść 120 L wody destylowanej (w centralnej części na ok. 1/3 wysokości)
  
• 
  rozpakować żel
  
• 
  oprzeć płytkę z żelem (żelem do góry) o wystający brzeg na powierzchni urządzenia aplikującego
  
• 
  ugiąć delikatnie żel do góry i powoli ułożyć go w miejscu zaznaczonym przez ramkę (nie wolno dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza)
  
• 
  osuszyć powierzchnię żelu przez szybkie położenie bibuły (wilgotną bibułę natychmiast zdjąć)
  
• 
  ramię aplikatora opuścić na dół w pozycję środkową i oprzeć o podpórkę wychyloną ku górze
  
• 
  ułożyć aplikator jednorazowego użytku na płaskiej powierzchni (napisami do góry)
  
• 
  nałożyć po 10 L surowicy do każdego otworu w aplikatorze (7) (próbki nałożyć w ciągu 2 minut)
  
• 
  odłamać ramkę zabezpieczającą zęby aplikatora (ostrożnie aby nie prysnęła zawartość dołków)
  
• 
  aplikator z próbkami włożyć w ramkę w pozycji nr 5 (aplikator musi być zwrócony cyframi do analityka)
  
• 
  opuścić ramkę aplikatora tak aby dotknął powierzchni żelu (nie używać siły przy opuszczaniu ramki)
  
• 
  po upływie 40 sekund zmienić pozycję pokrętła ku górze i usunąć aplikator
  
• 
  w pobliżu prawej krawędzi żelu na wysokości badanych próbek nałożyć za pomocą pipetki z kroplę dowolnej surowicy zabarwionej błękitem bromofenolowym
  
• 
  zdjąć płytkę z agarozą i umieścić ją w komorze elektroforetycznej tak, aby żel był skierowany do spodu, a miejsca nałożenia próbek znajdowały się po stronie katodowej (-) (żel powinien być zanurzony w buforze na ok. 1 cm po każdej stronie)
  
• 
  włączyć zasilanie (90V, 12±3 mA)
  
• 
  czas migracji 20 minut (±2 minuty) – obserwować położenie barwnika
  
• 
  po migracji wyłączyć zasilanie i wyjąć płytkę z żelem – umieścić ją na szklanej płytce i suszyć w temp. 80°C do całkowitego wyschnięcia (ok. 10 minut)
  

3. 
   Barwienie i odbarwianie
   

• 
  po wysuszeniu żel umieścić w ramce (ramka do przenoszenia płytek)
  
• 
  wlać odczynnik barwiący i odbarwiający do oddzielnych pojemników plastikowych
  

• 
  zanurzyć ramkę z żelem do roztworu barwiącego na 4 minuty
  
• 
  przenieść ramkę z żelem do roztworu odbarwiającego i delikatnie poruszając odbarwić tło, aż stanie się całkiem przejrzyste (jeżeli tło nie stanie się przejrzyste należy zmienić odbarwiacz na świeży)
  
• 
  suszyć żel w temp. 80°C do całkowitego wyschnięcia (ok. 10 minut)
  

• 
  rysunek żelu z zaznaczonymi frakcjami białkowymi