Ćwiczenie 10. Metody elektroforetyczne. Elektroforeza białek surowicy krwi w żelu agarozowym.
Zasada:
Elektroforeza białek polega na ich rozdziale na różnego typu podłożach w polu elektrycznym. Rozdział elektroforetyczny białek surowicy na żelu agarozowym pozwala na uzyskanie sześciu frakcji białek surowicy: albuminy, -globuliny, 2-globuliny, 1-globuliny, 2-globuliny, -globuliny. Każda z frakcji zawiera liczne białka indywidualne.
Materiały i sprzęt:
Zasilacz, aplikator próbek, komora do elektroforezy, pojemniki, zbiorniki do inkubacji, uchwyty do żeli, suszarka, cylindry miarowe, kolby miarowe, pipety automatyczne, bibuła cienka, ramka do przenoszenia płytek
Odczynniki – zestaw HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 (Sebia):
-
żel agarozowy
-
bufor Tris-barbitalowy (pH 8,5)
-
rozcieńczalnik barwnika
-
barwnik – czerń amidowa
-
roztwór odbarwiający
Wykonanie:
UWAGA! W czasie oznaczeń używać rękawiczek jednorazowych – oznaczenia są wykonywane na potencjalnie zakaźnym materiale biologicznym!
-
Przygotowanie próbek
-
Migracja
-
do każdej z części komory do elektroforezy nalać po 150 mL buforu Tris-barbitalowego
-
ustawić urządzenie aplikujące na płaskiej powierzchni, a nastepnie podnieść ramię z nadrukowanymi liczbami
-
na powierzchnię z nadrukowaną ramką nanieść 120 L wody destylowanej (w centralnej części na ok. 1/3 wysokości)
-
rozpakować żel
-
oprzeć płytkę z żelem (żelem do góry) o wystający brzeg na powierzchni urządzenia aplikującego
-
ugiąć delikatnie żel do góry i powoli ułożyć go w miejscu zaznaczonym przez ramkę (nie wolno dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza)
-
osuszyć powierzchnię żelu przez szybkie położenie bibuły (wilgotną bibułę natychmiast zdjąć)
-
ramię aplikatora opuścić na dół w pozycję środkową i oprzeć o podpórkę wychyloną ku górze
-
ułożyć aplikator jednorazowego użytku na płaskiej powierzchni (napisami do góry)
-
nałożyć po 10 L surowicy do każdego otworu w aplikatorze (7) (próbki nałożyć w ciągu 2 minut)
-
odłamać ramkę zabezpieczającą zęby aplikatora (ostrożnie aby nie prysnęła zawartość dołków)
-
aplikator z próbkami włożyć w ramkę w pozycji nr 5 (aplikator musi być zwrócony cyframi do analityka)
-
opuścić ramkę aplikatora tak aby dotknął powierzchni żelu (nie używać siły przy opuszczaniu ramki)
-
po upływie 40 sekund zmienić pozycję pokrętła ku górze i usunąć aplikator
-
w pobliżu prawej krawędzi żelu na wysokości badanych próbek nałożyć za pomocą pipetki z kroplę dowolnej surowicy zabarwionej błękitem bromofenolowym
-
zdjąć płytkę z agarozą i umieścić ją w komorze elektroforetycznej tak, aby żel był skierowany do spodu, a miejsca nałożenia próbek znajdowały się po stronie katodowej (-) (żel powinien być zanurzony w buforze na ok. 1 cm po każdej stronie)
-
włączyć zasilanie (90V, 12±3 mA)
-
czas migracji 20 minut (±2 minuty) – obserwować położenie barwnika
-
po migracji wyłączyć zasilanie i wyjąć płytkę z żelem – umieścić ją na szklanej płytce i suszyć w temp. 80°C do całkowitego wyschnięcia (ok. 10 minut)
-
Barwienie i odbarwianie
-
po wysuszeniu żel umieścić w ramce (ramka do przenoszenia płytek)
-
wlać odczynnik barwiący i odbarwiający do oddzielnych pojemników plastikowych
-
zanurzyć ramkę z żelem do roztworu barwiącego na 4 minuty
-
przenieść ramkę z żelem do roztworu odbarwiającego i delikatnie poruszając odbarwić tło, aż stanie się całkiem przejrzyste (jeżeli tło nie stanie się przejrzyste należy zmienić odbarwiacz na świeży)
-
suszyć żel w temp. 80°C do całkowitego wyschnięcia (ok. 10 minut)
UWAGA! Bufor z komory do elektroforezy zlać do specjalnego pojemnika na odpady toksyczne!
Sprawozdanie powinno zawierać:
-
rysunek żelu z zaznaczonymi frakcjami białkowymi
|