Mgr Krystiana Anna Krzyśko



Pobieranie 23.07 Kb.
Data07.05.2016
Rozmiar23.07 Kb.

mgr Krystiana Anna Krzyśko


  • Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, Pracownia Biomodelowania

  • Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii,

Pracownia Elektrochemii Organicznej

Autoreferat

MODELOWANIE STRUKTUR KOMPLEKSÓW OLIGOMERÓW

RECEPTORÓW GPCR Z TRIMEREM BIAŁKA G

NA PRZYKŁADZIE RODOPSYNY
Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR – ang. G protein coupled receptors) stanowią najliczniejszą a zarazem najbardziej zróżnicowaną pod względem ligandów rodzinę receptorów białkowych odpowiedzialnych za przenoszenie sygnałów do wnętrza komórki. Pośredniczą one zarówno w rozpoznawaniu bodźców środowiskowych takich jak: światło, zapach i smak, jak również uczestniczą w szlakach sygnałowych hormonów i innych cząsteczek. Wszystkie receptory GPCR, niezależnie od ich funkcji, mają budowę stosunkowo jednorodną: składają się one z siedmiu transmembranowych -helis połączonych ze sobą stosunkowo krótkimi pętlami. N-koniec receptora znajduje się po stronie zewnątrz komórkowej i zwykle zawiera miejsca glikozylacji, a C-koniec jest po stronie cytoplazmatycznej. Miejsce wiązania ligandu znajduje się we wnęce w obszarze transbłonowym receptora. Mimo, że rodzina ta jest bardzo liczna (ok. 1000 poznanych receptorów), dokładną strukturę poznano jedynie dla rodopsyny (2000r), a ostatnio także dla receptora beta-2-adrenergicznego (2007r).

Rodopsyna znajduje się w wydłużonych komórkach fotoreceptorowych oka zwanych pręcikami i jest głównym białkiem uczestniczącym w procesie widzenia. Po aktywacji białka przez kwant światła, rodopsyna aktywuje z kolei kilkaset cząsteczek białka G, które następnie aktywują inne białka efektorowe silnie wzmacniając przekazywany sygnał. Inaktywacja receptora następuje przez fosforylację rodopsyny i następnie przez związanie przez nią arestyny. Badania nad aktywacją rodopsyny pozwolą rzucić światło na podobne procesy, w których uczestniczą inne receptory z rodziny GPCR.

Wobec dużych trudności z krystalizacją receptorów GPCR, jest bardzo mało informacji strukturalnych o tych receptorach, szczególnie o ich stanach aktywnych. Dlatego też metody modelowania i symulacji mogą w istotny sposób przyczynić się do poznania struktur innych receptorów GPCR, a także do zanalizowania wpływu mutacji na strukturę i własności kompleksów tych receptorów.

Celem mojej rozprawy doktorskiej było zbudowanie struktury trimeru białka G z oligomerem rodopsyny oraz zbadanie oddziaływań pomiędzy molekułami tworzącymi ten kompleks w celu poznania mechanizmów przekazywania sygnału przez aktywną rodopsynę.

Do budowy kompleksu rodopsyna–białko G użyłam modelu oligomeru rodopsyny 1N3M z bazy PDB (ang. Protein Data Bank), niepotwierdzonego jeszcze wtedy przez badania eksperymentalne. Na jego podstawie zbudowałam model składający się z dwóch dimerów rodopsyny w komórce periodycznej. W skład jednego dimeru wchodziła aktywna rodopsyna. Model aktywnej rodopsyny stworzyłam poprzez izomeryzację retinalu do konformacji całkowicie-trans oraz przez rotację i odchylenie cytoplazmatycznej części helisy VI na zewnątrz białka.

Specyficzne dla rodopsyny białko G (transducyna - Gt) wymodelowałam na podstawie struktury krystalograficznej 1GOT z bazy PDB. Brakujące fragmenty tego białka zostały przeze mnie wymodelowane. Części te nie są widoczne w krysztale z powodu ich giętkości. Wymodelowałam też hydrofobowe modyfikacje białka G (myristyl i farnezyl) niezbędne do związania tego białka z rodopsyną. Określiłam również granice dopasowania i dozwolonej modyfikacji struktury białka G podczas tworzenia kompleksu oligomer rodopsyny - białko G oraz sprawdziłam możliwości ruchu podjednostek białka G - wyznaczając długookresowe drgania normalne tego białka korzystając z programu ANM (ang. Anizotropic Network Model). Drgania te pozwalają na wyznaczenie powolnych ruchów całych domen białka.

Korzystając z danych eksperymentalnych zadokowałam podjednostkę alfa białka G (Gtα) do aktywnej rodopsyny. Aby więzy eksperymentalne mogły być uwzględnione musiałam dokonać zmiany konformacji białka G, a w szczególności podjednostki Gt zgodnie z wyznaczonymi drganiami normalnymi. Drgania N- i C-końca Gtα wykorzystałam do osadzenia tej podjednostki na dimerze rodopsyny, a zginanie podjednostek α i βγ do dopasowania podjednostki βγ do oligomeru.

Z komplementarnej budowy podjednostki α białka G jak i dimeru rodopsyny wynikało, że najlepszym ułożeniem dla części α trimeru Gt jest ułożenie wzdłuż dimeru rodopsyny. Aktywna rodopsyna, z którą wiąże się C-koniec Gtα musiała mieć odsuniętą helisę VI (ruch ten wynika z aktywacji rodopsyny) tak, aby mógł się tam zmieścić C koniec Gtα. N-koniec Gtα został zadokowany równolegle do płaszczyzny błony we wnęce drugiej (nieaktywnej) rodopsyny

Ponieważ rodopsyna, oprócz dimeru, tworzy również większy oligomer powstaje pytanie, w jaki sposób pozostałe podjednostki białka G uczestniczą w tworzeniu kompleksu z rodopsyną. Aby to zbadać użyłam tetrameru rodopsyny. Podjednostki Gtβ i Gt zostały dołączone do podjednostki Gt tak jak występują w strukturze krystalicznej. Cały kompleks został początkowo zoptymalizowany tylko w miejscach kontaktu pomiędzy białkiem G a oligomerem rodopsyny.

Aby środowisko błonowe odpowiadało jak najbardziej natywnej błonie dysków z komórek pręcikowych gdzie docelowo przebywa rodopsyna, wprowadziłam do układu trzy rodzaje lipidów: fosfatydylocholinowe (PCDS), fosfatydyloetanolaminowe (PEDS) i fosfatydyloserynowe (PSDS). Lipidy PCDS tworzyły monowarstwę po stronie zewnątrzkomórkowej, a PEDS i PSDS tworzyły warstwę po stronie cytoplazmatycznej tak, aby lipidów PEDS było trzy razy więcej niż PSDS. Wszystkie lipidy zawierały nasycony łańcuch stearynowy (18:0) w pozycji sn1 i wielonienasycony łańcuch dokozaheksaenowy (22:6) w pozycji sn2.

Zarówno rodopsyna jak i białko G podlegają hydrofobowym modyfikacjom. W związku z tym badany kompleks został odpowiednio zmodyfikowany przez dodanie hydrofobowych łańcuchów: dwóch grup palmitynowych do Cys322 i Cys323 każdej z rodopsyn oraz łańcuch myristylowy do Gly2 z N-końca Gtα i łańcuch farnezylowy do Cys71 z C-końca Gtγ. Ponieważ C-koniec Gtγ nie jest widoczny w krysztale zbudowałam go w taki sposób, aby farnezyl związany z Cys71 mógł oddziaływać z myristylem z N końca podjednostki α, ponieważ oba te łańcuchy hydrofobowe kotwiczą białko G w membranie tworząc wspólną kotwicę.

Do tak przygotowanego układu dodałam wodę i przeciwjony. Całość poddałam kalibracji w temperaturze 310 K pod ciśnieniem 1013 hPa, przy zamrożonych wszystkich atomach białek. Ta procedura pozwoliła na dopasowanie się lipidów do sąsiadujących rodopsyn oraz wniknięcie wody do szczelin w białkach i do hydrofilowych części błony. Całość układu poddałam symulacji 9 ns bez nakładania jakichkolwiek więzów na atomy. Symulacja odbywała się w warunkach stałego ciśnienia (1013 hPa) i temperatury (310 K). W wyniku symulacji otrzymałam stabilny układ, w którym wszystkie oddziaływania wyznaczone z danych eksperymentalnych były zachowane.

Obie hydrofobowe modyfikacje białka G oddziaływały ze sobą podczas całej symulacji. Preferują one konformacje, w której ich łańcuchy węglowe są rozciągnięte jednocześnie oddziałując z sąsiadującymi z nimi fosfolipidami. W moim modelu myristyl i farnezyl znajdują się w przestrzeni pomiędzy kolejnymi dimerami jak również pomiędzy rzędami dimerów rodopsyny.

W badanym przeze mnie modelu kompleksu, jeden łańcuch palmitynowy zalazł się w strefie solwatacyjnej myristylu i farnezylu. Strefa ta jest otoczona średnio przez osiem lipidów i każdy z nich wystawia jeden łańcuch hydrofobowy do oddziaływań z kotwiczącą domeną Gt, co daje cztery całe fosfolipidy. Jest wykazane eksperymentalnie, że trimer Gt ściśle oddziałuje z 3 ± 1 fosfolipidami. Przyjmując, że lipidy te oddziałują z białkiem G oboma łańcuchami, wyniki tego eksperymentu są zgodne z wynikami mojej symulacji.

Po przeanalizowaniu struktury dimeru rodopsyny jak i białka G, można stwierdzić, że podjednostka Gtα białka G pasuje do wnęk w cytoplazmatycznej części dimeru rodopsyny. Na podstawie odległości pomiędzy rodopsynami w błonie otrzymanych za pomocą badań Atomic Force Microscopy (AFM) oraz struktury krystalograficznej rodopsyny jak i białka G, można przypuszczać, że w wiązaniu białka G uczestniczą cztery rodopsyny.

Taką lokalizację C-końca potwierdzają eksperymenty krosslinkowania oraz mutagenezy. Acharya i współpracownicy zidentyfikowali oddziaływania Tyr136   Val139 pomiędzy TM III z rodopsyny a transducyną. Grupa Khorany wykazała, że aminokwasy Leu19–Arg28, Arg310–Lys313 and Glu342–Lys345 transducyny są krosslinkowane do Ser240Cys w pętli C3 aktywnej rodopsyny. Natomiast aminokwasy znajdujące się w H8, Asn310 Gln312, oddziałują z aminokwasami 340-350 podjednostki α transducyny. Jednoczesne spełnienie tych wymogów jest możliwe tylko przy zadokowaniu białka G do oligomeru rodopsyny a nie jak dotychczas sądzono do monomeru.

Pomiędzy dimerami oraz pomiędzy rzędami dimerów rodopsyny jest wystarczająca ilość miejsca, aby nastąpiła zmiana struktury rodopsyny na aktywną, w tym największe zakładane przesunięcie – odsunięcie cytoplazmatycznego końca helisy VI na zewnątrz białka. Helisa VI nie bierze udziału w formowaniu oddziaływań pomiędzy dimerami, a zmiana jej położenia jedynie nieznacznie wpływa na partnera w dimerze rodopsyny. Takie ustawienie umożliwia transducynie łatwe przemieszczanie się wzdłuż rzędów dimerów rodopsyn i wyszukiwanie rodopsyny w stanie aktywnym.

W wyniku aktywacji rodopsyny ulega m.in. przerwaniu mostek solny pomiędzy TM III i TM VI, a uwolniona helisa VI może odchylić się i utworzyć wnękę po stronie cytoplazmatycznej dla przyjęcia białka G. Na podstawie moich badań mogę stwierdzić, że grupa karboksylowa ostatniego aminokwasu podjednostki Gt, Phe350 oddziałuje z resztą argininy z motywem D(E)RY w kompleksie Rho4-Gt.

Z kształtu dimeru oraz białka G wynika, że do poprawnego zadokowania białka G potrzebna jest tylko jedna aktywna rodopsyna. Jest to rodopsyna, do której dokuje się część α białka G. Jednakże, jeśli będzie więcej aktywnych rodopsyn (dwie, trzy, czy cztery), nie wpłynie to negatywnie na przyłączenie transducyny, ani też tego nie ułatwi. Kiedy podjednostka βγ oddysocjuje, a inna transducyna będzie chciała połączyć się z rodopsyną i zostać aktywowana, wówczas obecność podjednostki α obok wolnej, aktywnej rodopsyny jest korzystna, bo obie podjednostki α mogą oddziaływać ze sobą. Te oddziaływania obu podjednostek Gt ułatwiają przyłączenie się nowego trimeru białka Gt do sąsiedniego tetrameru rodopsyny.

Białko G jest zakotwiczone w błonie dzięki farnezylowi (związany do Gly2 Gtα) i myristylowi (związany do Cys71 Gtγ). Tworzą one pojedynczą kotwicę utrzymującą kompleks Gt w błonie. Podczas aktywacji białka G następuje przemieszczenie farnezylu z błony do wnętrza podjednostki Gtβ. Aby do takiego przemieszczenia doszło, konformacja C końca podjednostki γ musi ulec zmianie. Domena C-końcowa Gtγ (reszty 60-71) ulega zmianie z niezorganizowanego łańcucha na -helisę i jednocześnie farnezyl jest wyciągany z błony. Następstwem tych zmian jest oddysocjowanie podkompleksu Gtβγ. Na koniec również Gtα odłącza się od aktywnej rodopsyny dając tym samym możliwość aktywacji następnego białka G.



Przeprowadziłam także 10 ns symulacje MD dla trzech układów z farnezylem (I. farnezyl zanurzony w błonie, II. kompleks farnezylu i myristylu zanurzony w błonie, III. kompleks farnezylu, myristylu i łańcuchów palmitynowych z rodopsyny zanurzony w błonie). Zmierzona energia oddziaływania wskazuje, że oddziaływanie farnezylu z błoną nieznacznie się zmniejsza po dodaniu myristylu (około -10 kcal/mol). Te brakujące 10 kcal/mol możemy odnaleźć w oddziaływaniach farnezylu z myristylem. Sam myristyl ma mniejszą wartość średniej energii oddziaływania z błoną niż farnezyl. Dodanie do układu łańcuchów palmitynowych znów obniża energię oddziaływania farnezylu z błoną (około -5 kcal/mol).

Do zbadania procesu wyciągania farnezylu z błony użyłam metody SMD (ang. Steered Molecular Dynamics). Przeprowadziłam symulacje wyciągania farnezylu z błony dla układów I, II i III. Porównując ze sobą te symulacje wyraźnie widać, że myristyl utrudnia wyciąganie z błony farnezylu. Na całkowite wyjście farnezylu z błony było potrzebne 385 ps, zaś w kompleksie z myristylem 490 ps. W układzie z łańcuchami palmitynowymi (układ III) farnezyl wyszedł o 60 ps później z błony niż w układzie I, ale wcześniej niż w układzie II. Można przypuszczać, że oddziaływania farnezylu i myristylu z łańcuchami palmitynowymi pozwalają na łatwiejsze wyjście farnezylu z błony w celu oddysocjowania podkompleksu Gtβγ. Poznanie mechanizmów przekazywania sygnału przez aktywną rodopsynę może przyczynić się do powstania leków, aby przywrócić zaburzone funkcje sygnalizacyjne rodopsyny.




©absta.pl 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna