Potencjometryczna detekcja aktywności fosfataz w surowicy krwi”



Pobieranie 10.9 Kb.
Data01.05.2016
Rozmiar10.9 Kb.
mgr Dominika Agnieszka Ogończyk Warszawa, dn. 05.09.2008

Wydział Chemii UW

Pracownia Teoretycznych Podstaw

Chemii Analitycznej

Autoreferat rozprawy doktorskiej
Potencjometryczna detekcja aktywności fosfataz w surowicy krwi”
Promotor: dr hab. Robert Koncki

Oznaczanie aktywności enzymów w płynach fizjologicznych człowieka jest nieodzowne w diagnostyce medycznej. Praktyka kliniczna wielokrotnie pokazała, iż określanie i monitorowanie zmian aktywności fosfataz: alkalicznej (ALP) i kwaśnej (ACP) dostarcza informacji o rozpoznaniu i skuteczności leczenia wielu chorób. Zwiększone uwalnianie ALP do krwi obserwuje się w różnych stanach chorobowych wątroby oraz kości. Obniżona aktywność tego biokatalizatora jest rzadko spotykana; występuje przy niedoczynności tarczycy oraz w niektórych chorobach dziedzicznych. Natomiast podwyższona aktywność ACP może świadczyć o chorobach nowotworowych, schorzeniach krwi czy schorzeniach wątroby.

W enzymatycznej diagnostyce laboratoryjnej wykorzystuje się również obraz izoenzymograficzny. Określanie aktywności izoenzymów dostarcza dokładnej informacji o stanie poszczególnych narządów wewnętrznych. Oznaczając izoformy fosfatazy alkalicznej można dokładnie ocenić stan pacjenta ze schorzeniami układu szkieletowego czy układu metabolicznego. Z kolei oznaczanie aktywności izoformy sterczowej fosfatazy kwaśnej umożliwia określanie efektów terapii raka gruczołu krokowego.

Istnieje wiele elektrochemicznych i optycznych metod detekcji aktywności fosfataz. Jednak, stosowanie tych technik związane jest z koniecznością posługiwania się zaawansowanym i kosztownym instrumentarium czy drogimi, często niedostępnymi komercyjnie bądź nietrwałymi odczynnikami.


Głównym celem pracy doktorskiej było opracowanie prostego, taniego systemu detekcji aktywności fosfataz: alkalicznej i kwaśnej z zastosowaniem dostępnego komercyjnie, niedrogiego i stabilnego chemicznie substratu.

Podstawowe wymagania stawiane współczesnej analizie laboratoryjnej to krótki czas wykonywania oznaczeń, jak najdalej posunięta mechanizacja postępowania czy automatyzacja układu pomiarowego. Dlatego też, kolejnym celem badań była mechanizacja opracowanego systemu detekcji aktywności fosfataz, która polegała na zaadaptowaniu go do warunków wstrzykowej analizy przepływowej. Techniki analiz przepływowych to przykład bardzo prostej i uniwersalnej automatyzacji, która łączy w sobie wiele zalet, takich jak: prowadzenie pomiarów w stałych warunkach fizycznych, duża odtwarzalność rejestrowanych sygnałów, prosta konstrukcja układu pomiarowego, zminimalizowanie zużycia próbki i odczynników, praca w układzie zamkniętym. Ta ostatnia związana jest ze zmniejszeniem ryzyka zanieczyszczenia roztworów i większym bezpieczeństwem pracy analityka.


Istotnym celem pracy doktorskiej było też pokazanie użyteczności opracowanych układów. Zoptymalizowane systemy FIA posłużyły do oznaczania ALP oraz ACP w szerokich zakresach ich aktywności w syntetycznych roztworach preparatów enzymatycznych, w roztworach surowic kontrolnych oraz w rzeczywistych próbkach surowicy ludzkiej krwi.
W pracy wykazano, iż monofluorofosforan disodu jest dogodnym substratem do oznaczania aktywności zarówno ALP, jak i ACP. W przeciwieństwie do wielu organicznych fosforanów wykorzystywanych w metodach optycznych i amperometrycznych, nieorganiczny MFP jest substancją tanią, komercyjnie dostępną oraz stabilną chemicznie. Enzymatyczną reakcję hydrolizy MFP można z łatwością monitorować stosując wysokoselektywną i czułą potencjometryczną elektrodę fluorkową. Opracowany system detekcji łączy w sobie wiele zalet. Jego konstrukcja jest prosta, bazuje na taniej potencjometrycznej aparaturze oraz łatwo dostępnym substracie. Zaprezentowany system nadaje się do szybkiego i selektywnego oznaczania aktywności ALP i ACP zarówno w próbkach prostych (syntetyczne roztwory preparatów enzymatycznych), jak i złożonych (standardy surowicy krwi).

W pracy przedstawiono również automatyzację systemu do oznaczania aktywności ALP, optymalizację układu, jego zalety oraz zastosowanie kliniczne. Opracowany system FIA to tanie i wygodne narzędzie do badań biochemicznych krwi. Umożliwia oznaczanie aktywności ALP w surowicy ludzkiej krwi na poziomie fizjologicznym i patologicznym. Otrzymane rezultaty badań charakteryzowały się dobrymi parametrami analitycznymi. Dodatkową zaletą systemu jest możliwość stosowania oznaczeń izoform fosfatazy alkalicznej. Opracowany, potencjometryczny system detekcji może stanowić alternatywę dla kosztownych technik amperometrycznych czy spektrofotometrycznych, wykorzystywanych powszechnie w laboratoriach analizy klinicznej.



Zaprezentowano również całkowitą mechanizację postępowania analitycznego dla oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej. Przedstawiono różne modele układów FIA, jak również ich optymalizację i kalibrację. Dodatkowo, zaprezentowano analizę izoenzymów ACP.
Część wyników badań przeprowadzonych w toku realizacji rozprawy doktorskiej została przedstawiona w następujących publikacjach:
  R. Koncki, D. Ogończyk, S. Głąb, „Potentiometric assay for acid and alkaline  phosphatase”, Anal. Chim. Acta, 538 (2005) 257-261
  D. Ogończyk, R. Koncki, „Potentiometric flow-injection system for determination of  alkaline phosphatase in human serum”, Anal. Chim. Acta, 600 (2007) 194-198.




©absta.pl 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna