Rozprawa doktorska Promotor: prof dr hab med. Janusz Marcinkiewicz



Pobieranie 233.23 Kb.
Strona7/11
Data07.05.2016
Rozmiar233.23 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

4.2 Cytotoksyczność TauCl i TauBr


Cytotoksyczność badanych związków w hodowlach komórkowych in vitro mierzono przy pomocy testu MTT. Po 24 godzinach inkubacji komórek makrofagowych (RAW 264.7) ze wzrastającymi stężeniami TauCl i TauBr znamienna cytotoksyczność występuje przy stężeniu ok. 250 μM zarówno dla TauCl, jak i TauBr; TauCl jest w tym stężeniu bardziej toksyczna (ryc. 7.). Dla hodowanych ex vivo przez 24 godziny mysich makrofagów otrzewnowych stężenie to wynosi ok. 300 μM dla obu związków (ryc. 8). Dla komórek śródbłonka (linia ECV 304) znamienna cytotoksyczność występuje przy 300 μM dla TauBr i 1 mM dla TauCl (ryc. 9).



Ryc. 7. Cytotoksyczność tauryny i jej pochodnych wobec komórek RAW 264.7 w zależności od stężenia wyjściowego. Komórki inkubowano in vitro przez 24 godziny z różnymi stężeniami TauCl i TauBr (Tau zastosowano jako kontrolę). Żywotność komórek badano testem MTT. Przedstawione wyniki stanowią średnią (+/- SD) z trzech oddzielnych eksperymentów.



Ryc. 8. Cytotoksyczność pochodnych tauryny wobec mysich makrofagów otrzewnowych (hohowla ex vivo) w zależności od stężenia wyjściowego. Komórki inkubowano in vitro przez 24 godziny z różnymi stężeniami TauCl i TauBr (nie zastosowano kontroli Tau). Przedstawione wyniki stanowią średnią (+/- SD) z trzech oddzielnych eksperymentów.


Ryc. 9. Cytotoksyczność tauryny i jej pochodnych wobec komórek ECV 304 w zależności od stężenia wyjściowego. Komórki inkubowano in vitro przez 24 godziny z różnymi stężeniami TauCl i TauBr (Tau zastosowano jako kontrolę). Żywotność komórek badano testem MTT. Przedstawione wyniki stanowią średnią (+/- SD) z trzech oddzielnych eksperymentów.

Cytotoksyczność in vivo badano podając oba związki dootrzewnowo myszom w ilości 1 ml przy stężeniu 1-7 mM, a następnie wypłukując makrofagi otrzewnowe po 60 min. i oceniając ich zdolność do zahamowania wchłaniania błękitu trypanu. Stwierdzono zależny od wyjściowego stężenia efekt cytotoksyczny: dla TauCl odsetek żywych komórek maleje od ok. 92% dla 1 mM do 63% dla 7 mM, dla TauBr wartości te wynoszą odpowiednio 90 i 74% (ryc. 10). Jako maksymalne do doświadczeń in vivo przyjęto stężenie 5 mM, przy którym dla obu związków odsetek żywych komórek wynosi ok. 76% i nie ulega istotnej zmianie po 24 godzinach hodowli ex vivo.





Ryc. 10. Cytotoksyczność pochodnych tauryny wobec mysich makrofagów otrzewnowych in vivo w zależności od stężenia wyjściowego. TauCl i TauBr podawano dootrzewnowo myszom, u których wcześniej wywołano zapalenie otrzewnej (nie zastosowano kontroli Tau). Żywotność komórek oceniano ex vivo testem eliminacji błękitu trypanu po 60 min. od podania badanych związków. Przedstawione wyniki stanowią średnią (+/- SD) z trzech oddzielnych eksperymentów.

Przeprowadzone eksperymenty pozwalają na sformułowanie następujących wniosków:



  • Dla obu związków znamienna cytotoksyczność in vitro w hodowli komórkowej trwającej 24 godziny występuje przy stężeniu ok. 250-300 μM.

  • Różne typy komórek wykazują różną wrażliwość na badane substancje – dla komórek linii makrofagowej bardziej toksyczna jest TauCl, dla linii śródbłonkowej – TauBr.

  • Aby uniknąć działania cytotoksycznego in vivo wskazane jest podawanie badanych związków w stężeniu nie przekraczającym 5 mM.


4.3 Transport TauCl przez błonę komórkową


W opracowanym modelu doświadczalnym komórki RAW 264.7 inkubowano ze wzrastającymi stężeniami Tau lub TauCl oraz stałą ilością H3-Tau. Jako kontroli wychwytu tauryny używano GES – inhibitora białka TauT. Tauryna powodowała w tej sytuacji kompetycyjne zahamowanie wychwytu H3-Tau przez komórki w sposób zależny od stężenia Tau. Zbadanie transportu TauBr w tym modelu nie było możliwe z uwagi na znaczny nadmiar tauryny pozostający w mieszaninie reakcyjnej po wytworzeniu TauBr (p. rozdział 3.3.3).

Wykazano, że tauryna i TauCl współzawodniczą o ten sam transporter (TauT, ulegający zahamowaniu pod wpływem GES): inkubacja z TauCl powoduje – analogicznie jak w przypadku tauryny – zależne od jej stężenia kompetycyjne zahamowanie wnikania H3 Tau do komórek (ryc. 11). Uzyskane wyniki nie dają jednak jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, czy TauCl jest transportowana do wnętrza komórki przy pomocy TauT, czy też jedynie blokuje go uniemożliwiając transport H3-Tau.



Ryc. 11. Wpływ tauryny i TauCl na wychwyt H3-Tau przez komórki RAW 264.7; oba związki powodują kompetycyjne zahamowanie wychwytu H3-Tau. „Emisja” oznacza liczbę scyntylacji zarejestrowanych przez licznik wyrażoną w procentach w odniesieniu do grupy kontrolnej (tj. komórek inkubowanych z H3-Tau bez obecności Tau bądź TauCl – p. rozdział 3.3.6) Przedstawione wyniki stanowią średnią (+/- SD) z czterech oddzielnych eksperymentów.

4.4 Ocena wpływu badanych związków na aktywność sekrecyjną makrofagów in vitro


Badanie wpływu TauCl i TauBr na aktywność sekrecyjną komórek odczynu zapalnego przeprowadzono na aktywowanych in vitro (LPS + IFN-γ) dwóch typach mysich komórek makrofagowych: linii makrofagowej RAW 264.7 oraz makrofagów wysięku otrzewnowego.

Wykazano, że w stężeniach niecytotoksycznych zarówno TauCl jak i TauBr w podobny, zależny od dawki sposób hamują uwalnianie tlenku azotu (badanego poprzez pomiar stężenia azotynów – trwałego metabolitu NO) oraz IL-6 przez komórki RAW 264.7; nie wykazano wpływu tych związków na uwalnianie TNF-α (ryc. 12-14).

Dla aktywowanych mysich makrofagów otrzewnowych obserwowano zahamowanie wydzielania IL-6, IL-10, IL-12 oraz TNF α zarówno pod wpływem TauCl, jak i TauBr (ryc. 12).

Oba związki wykazują podobne działanie, jednakże TauCl działa silniej od TauBr – w takim samym stężeniu wywołuje większe zahamowanie uwalniania badanych związków. Obserwacja ta dotyczy zarówno komórek RAW 264.7, jak i makrofagów wysięku otrzewnowego.




*

*

*


Ryc. 12. Wpływ Tau, TauCl i TauBr na aktywność sekrecyjną komórek RAW 264.7 – uwalnianie tlenku azotu. Komórki umieszczano w medium ze wzrastającymi stężeniami badanych związków, po 15 min. aktywowano przy pomocy LPS (0,1 μg/ml) i IFN-γ (20 U/ml), a następnie inkubowano przez 24 h. Przedstawione wyniki stanowią średnią (+/- SD) z trzech oddzielnych eksperymentów. *p<0,05 (względem kontroli).


*

*

*

*


Ryc. 13. Wpływ Tau, TauCl i TauBr na aktywność sekrecyjną komórek RAW 264.7 – uwalnianie IL-6. Komórki umieszczano w medium ze wzrastającymi stężeniami badanych związków, po 15 min. aktywowano przy pomocy LPS (0,1 μg/ml) i IFN-γ (20 U/ml), a następnie inkubowano przez 24 h. Przedstawione wyniki stanowią średnią (+/- SD) z trzech oddzielnych eksperymentów. *p<0,05 (względem kontroli).


Ryc. 14. Wpływ Tau, TauCl i TauBr na aktywność sekrecyjną komórek RAW 264.7 – uwalnianie TNF-. Komórki umieszczano w medium ze wzrastającymi stężeniami badanych związków, po 15 min. aktywowano przy pomocy LPS (0,1 μg/ml) i IFN-γ (20 U/ml), a następnie inkubowano przez 24 h. Przedstawione wyniki stanowią średnią (+/- SD) z trzech oddzielnych eksperymentów. Nie stwierdzono istotnego statystycznie wpływu badanych związków na uwalnianie TNF α.


A.




B.


D.


C.


0

25

50

75

100

100

300

TauBr

TauCl

**

**

**

**

**

**

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Stężenie [M]

Stężenie [M]

Stężenie [M]



: Content
Content -> Punktacja uczniów kl. 1-3
Content -> Dane osobowe
Content -> Tworzenie aplikacji mobilnych do monitoringu środowiska nowa specjalność magisterska w języku angielskim
Content -> SzczegóŁowy opis tematu zamówienia
Content -> Port Lotniczy im. Mikołaja Kopernika we Wrocławiu Wroclaw Nicolaus Copernicus Airport Rozkład lotów lato 2012 Flight schedule summer 2012
Content -> Port Lotniczy im. Mikołaja Kopernika we Wrocławiu
Content -> 14 nowych wariantów rolek do zaginania taśm transportowych od igus
Content -> SzczegóŁowy opis zamówienia
Content -> Abc posługi pasterskiej dla kapłana opiekuna/pasterza Wspólnoty ze Szkoły Nowej Ewangelizacji (sne)
Content -> SzczegóŁowy opis przedmiotu zamówienia prowadzonego w trybie przetargu nieograniczonego nr bzp/PN/160/2014


1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


©absta.pl 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna