Ćwiczenie Filtracja żelowa (sączenie molekularne) Zasada: Substancje w zależności od wielkości cząsteczek (średnicy), mają różną zdolność penetracji ziaren żelu. Cząsteczki duże nie wnikają do wnętrza ziaren



Pobieranie 56.23 Kb.
Data05.05.2016
Rozmiar56.23 Kb.
Ćwiczenie 9. Filtracja żelowa (sączenie molekularne)

Zasada:

Substancje w zależności od wielkości cząsteczek (średnicy), mają różną zdolność penetracji ziaren żelu. Cząsteczki duże nie wnikają do wnętrza ziaren. Związki niskocząsteczkowe łatwo wchodzą do wnętrza ziaren. Cząsteczki większe są eluowane wcześniej niż mniejsze.



  1. Odsalanie roztworu białka na żelu Sephadex G-25

Materiały i sprzęt:

Spektrofotometr Marcel MINI, kolumna plastikowa o wymiarach 1 x 10 cm, nasadka na kolumnę – pojemnik na roztwór elucyjny, zlewki, probówki Eppendorf (15), kuwety plastikowe, pipeta automatyczna



Odczynniki:

  • Sephadex G-25 w 0,9% NaCl

  • 0,9% NaCl

  • roztwór cytochromu c w 0,9% NaCl (3 mg/mL)

  • roztwór chromianu (VI) potasu w 0,9% NaCl (2 mg/mL)

Wykonanie:

  1. Przygotowanie kolumny chromatograficznej

  • zdjąć zamknięcie kolumny, nałożyć na kolumnę plastikową nasadkę, wypełnić roztworem 0,9% NaCl

  • otworzyć wypływ kolumny i pozwolić na wypływ roztworu z kolumny do wysokości słupa żelu

  • zamknąć wypływ i zdjąć nasadkę

! Nie powinno się dopuścić do całkowitego wycieku roztworu z kolumny i zapowietrzenia złoża żelowego!

  1. Przygotowanie mieszaniny – w probówce Eppendorf zmieszać 0,25 mL roztworu cytochromu c z 0,25 mL roztworu chromianu (VI) potasu

  2. Rozdział chromatograficzny

  • przygotować probówki Eppendorf – zaznaczyć pisakiem objętość 1 mL

  • przy zamkniętym wypływie nanieść mieszaninę na szczyt kolumny

  • otworzyć wypływ i pozwolić na „wejście” mieszaniny do wysokości słupa żelu i natychmiast zamknąć wypływ

  • nanieść na szczyt kolumny 2 mL 0,9% NaCl i ponownie otworzyć wypływ pozwalając na „wejście” roztworu do wysokości słupa żelu – zamknąć wypływ

  • nałożyć nasadkę i wypełnić roztworem 0,9% NaCl (w czasie rozdziału uzupełnić wypływający 0,9% NaCl)

  • otworzyć wypływ i zbierać frakcje 1 mL do 15 probówek (15 mL)

  • po zakończeniu zbierania frakcji 2-krotnie przepłukać kolumnę za pomocą 0,9% NaCl (2-krotnie wypełnić kolumnę i zlać zawartość do zlewki)

  • zakończyć wypływ w chwili gdy 0,9% NaCl znajdzie się na wysokości 1 cm od złoża, zdjąć zbiornik i zamknąć kolumnę

  1. Oznaczenia spektrofotometryczne - w poszczególnych frakcjach zmierzyć absorbancję względem 0,9% NaCl przy długości fali

  • 410 nm (chromian (VI) potasu) - program 14

  • 540 nm (cytochrom c) – program 13

Sprawozdanie powinno zawierać:

  • tabelę wyników:

Nr frakcji

Objętość [mL]

A410 nm

A540 nm

1

1







2

2







3

3







4

4







5

5







6

6







7

7







8

8







9

9







10

10







11

11







12

12







13

13







14

14







15

15










  • graficzne przedstawienie wyników (wykres zależności absorbancji od objętości elucyjnej)

  1. Oddzielanie hemoglobiny od jonów Na+ i Cl- na sicie molekularnym typu Sephadex G-25

Materiały i sprzęt:

Spektrofotometr Marcel MINI, kolumna plastikowa o wymiarach 1 x 10 cm, nasadka na kolumnę – pojemnik na roztwór elucyjny, zlewki, probówki Eppendorf, kuwety plastikowe, pipety automatyczne



Odczynniki:

  • Sephadex G-25

  • woda destylowana

  • mieszanina hemoglobiny i 1,5% NaCl

  • 0,1 mol/L roztwór AgNO3

Wykonanie:

  1. Przygotowanie kolumny chromatograficznej

  • zdjąć zamknięcie kolumny, nałożyć na kolumnę plastikową nasadkę, wypełnić wodą destylowaną

  • otworzyć wypływ kolumny i pozwolić na wypływ roztworu z kolumny do wysokości słupa żelu

  • zamknąć wypływ i zdjąć nasadkę

! Nie powinno się dopuścić do całkowitego wycieku roztworu z kolumny i zapowietrzenia złoża żelowego!

  1. Rozdział chromatograficzny

  • przygotować probówki Eppendorf – zaznaczyć pisakiem objętość 1 mL

  • przy zamkniętym wypływie nanieść mieszaninę na szczyt kolumny

  • otworzyć wypływ i pozwolić na „wejście” 0,25 mL mieszaniny do wysokości słupa żelu i natychmiast zamknąć wypływ

  • nanieść na szczyt kolumny 2 mL H2O destylowanej i ponownie otworzyć wypływ pozwalając na „wejście” roztworu do wysokości słupa żelu – zamknąć wypływ

  • nałożyć nasadkę i wypełnić H2O destylowanej (w czasie rozdziału uzupełnić wypływającą H2O dest.)

  • otworzyć wypływ i zbierać frakcje 1 mL do probówek Eppendorf

  • po zakończeniu zbierania frakcji 2-krotnie przepłukać kolumnę za pomocą 0,9% NaCl, a następnie H2O destylowanej (2-krotnie wypełnić kolumnę i nasadkę, a następnie zlać zawartość do zlewki)

  • zakończyć wypływ w chwili gdy H2O dest. znajdzie się na wysokości 1 cm od złoża, zdjąć zbiornik i zamknąć kolumnę

  1. Oznaczenia spektrofotometryczne - oznaczyć stężenie hemoglobiny w pobranych frakcjach (program 30)

Odczynniki:

  • pobrane frakcje

  • odczynnik Drabkina

  • wzorzec cyjanomethemoglobiny (stężenie 15,11 g/dL)

Wykonanie:

  • opisać probówki, odmierzyć odpowiednie objętości roztworów i postępować zgodnie z opisem podanym w tabeli poniżej:







Próbka badana

Próbka zerowa

Odczynnik Drabkina [mL]

1,25

1,25

Frakcje [L]

5

-

H2O destylowana [L]

-

5

Inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej

Odczytać absorbancję próby badanej i wzorca wobec próby zerowej przy =546 nm



Obliczyć stężenie hemoglobiny:
Abadana

CHb = ∙ cwzorca [g/dL]

Awzorcowa




  1. Oznaczenia chlorków – do każdej frakcji otrzymanej z kolumny dodać po 0,2 mL 0,1 mol/L AgNO3 i zawartość dobrze wymieszać (Vortex). We frakcjach zawierających jony chlorkowe wytrąca się osad chlorku srebra – rozdział prowadzić tak długo aż w wycieku z kolumny przestanie zachodzić reakcja z AgNO3, świadcząca o wymyciu jonów chlorkowych.

  2. Po zakończonym rozdziale kolumnę należy przemyć ok. 100 mL H2O destylowanej, nie dopuszczając do zapowietrzenia żelu


Sprawozdanie powinno zawierać:

  • tabelę wyników:

Nr frakcji

Objętość [mL]

A540 nm

Obecność Cl-

1

1







2

2







3

3







4

4







5

5







6

6







7

7







8

8







9

9







10

10







11

11







12

12







13

13







14

14







15

15




















  • graficzne przedstawienie wyników - wykres zależności stężenia hemoglobiny od objętości elucyjnej oraz zależność zawartości chlorków od objętości elucyjnej.

!Zawartość chlorków oceniać na podstawie zmętnienia próbki według orientacyjnej skali liczbowej!







©absta.pl 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna