Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu



Pobieranie 31.38 Kb.
Data09.05.2016
Rozmiar31.38 Kb.



Zakład Biologii Molekularnej

Materiały do ćwiczeń z przedmiotu:

„BIOLOGIA MOLEKULARNA”


Zakład Biologii Molekularnej

Wydział Farmaceutyczny, WUM

ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa

farmacjamolekularna@wum.edu.pl

IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ. REAKCJA PCR. ELEKTROFOREZA

W ŻELU AGAROZOWYM
UWAGA!!! Wykonanie procedury należy bezwzględnie przeprowadzić w rękawiczkach!
1. Izolacja DNA z hodowli komórkowej

Przygotowanie materiału i protokół izolacji DNA



  • Pelet z komórek dokładnie zawiesić (przepipetować) w 100μl buforu Tris

  • Dodać 200μl uniwersalnego buforu lizującego LT

  • Dodać 20 μl roztworu Proteinazy K

  • Całość wymieszać (worteksować 20 s) i inkubować w temp. 37oC (20 min)

  • Przenieść próbkę do 75oC i inkubować 5 min.

  • Próbkę intensywnie worteksować 20 s

  • Wirować 3 min przy 12 tyś. RPM

  • Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do oczyszczania genomowego DNA

  • Wirować 1 min. przy 12 tyś. RPM

  • Wyjąć minikolumnę usunąć przesącz z dolnej probówki. Kolumnę umieścić ponownie w tej samej dolnej probówce. Do kolumny dodać 500μl roztworu płuczącego A1 (DNA znajduje się na minikolumnie)

  • Wirować 1 min. przy 12 tyś. RPM

  • Usunąć przesącz z dolnej probówki i dodać do minikolumny 400 μl roztworu płuczącego A1 (DNA znajduje się na minikolumnie)

  • Wirować 2 min. przy 12 tyś. RPM

  • Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce 2 ml (probówka bez wieczka) i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 200 μl buforu Tris uprzednio ogrzanego do temp.75oC

  • Inkubować próbkę przez 5 min. w temp. pokojowej

  • Wirować 1 min. przy 12 tyś. RPM



  • Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przenieść do eppendorfa przetrzymywać w lodówce do czasu dalszych analiz (2-8 °C - krótkie przechowywanie, -20 °C długie przechowywanie) lub użyć bezpośrednio do reakcji PCR.


2.Wykonanie reakcji PCR

Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej




    • Należy wykonać mieszaninę reakcyjną na 4 osoby ( 4 reakcje) zgodnie z tabelą

Skład mieszaniny reakcyjnej






1 reakcja

4 reakcje

Bufor 10x

2µl




dNTP

2µl




starter F

1µl




starter R

1µl




polimeraza

0,5µl




H2O

uzupełnić do 18µl







    • Mieszaninę wymieszać i rozdzielić po 18 µl do 4 opisanych probówek (dla każdego studenta 1 probówka).

    • Do probówki dodać 2 µl swojej matrycy (wyizolowanego DNA). Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej - 20µl.

    • Próby wymieszać przez worteksowanie lub kilkukrotne pipetowanie.

Po przygotowaniu mieszaniny reakcyjnej i po dodaniu do niej matrycy w odpowiedniej ilości jak zamieszczono powyżej należy przeprowadzić reakcję PCR.

Reakcje PCR wykonujemy w termocyklerze, który umożliwia płynną zmianę temperatury.

Etapy reakcji PCR


  1. Denaturacja.- pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA. W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 °C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95° na 15 sekund.

  2. Annealing – hybrydyzacja odcinków starterowych. Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (zwykle ok 50-60 °C), które przyłączają się do matrycy.

  3. Elongacja – Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 °C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, na skutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.

Po zakończonej reakcji PCR próby można przechowywać (przez noc w temperaturze 2-8 °C, długie przechowywanie -20 °C ) lub nanieść próbkę na żel agarozowy


3. Elektroforeza produktów reakcji PCR
Produkt reakcji identyfikujemy rozdzielając uzyskany materiał w żelu agarozowym. Równocześnie z badanym genem nanosimy na żel standardy masowe - fragmenty DNA o znanych masach cząsteczkowych wyrażonych w ilości par zasad. Na podstawie położenia w stosunku do standardów masowych określamy wielkość i specyficzność produktu.

Potrzebne materiały i odczynniki:




Bufor do elektroforezy TAE 1x (10x TAE: 40mM Tris, 0,12 % kwas octowy, 1mM EDTA pH 8,0)

Agaroza

SybrSafe / bromek etydyny

Obciążnik (10x obciążnik: 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol, 20% ficoll typ 400)

Saneczki, grzebienie i komora elektroforetyczna

Wzmacniacz prądu

Parafilm

Kuchenka mikrofalowa



Przygotowanie żelu agarozowego

  1. Saneczki włożyć w formę i wyważyć jej równowagę

  2. Przygotować grzebienie

  3. Przygotować żel agarozowy 1% w objętości X ml

Miejsce na obliczenia


  1. Odpowiednią naważkę agarozy rozpuścić na gorąco w buforze TAE 1x

  2. Klarowny roztwór agarozy ochłodzić do temp ok 50ºC

  3. Pod wyciągiem, do roztworu agarozy dodać 4 µl bromku etydyny, zamieszać

  4. Wylać żel na sanaczki, uważając by nie pojawiły się bąble powietrza

5. Umieścić grzebienie

Żel polimeryzuje ok 20 min



Elektroforeza w żelu agarozowym

  1. Z żelu wyciągnąć grzebień i przenieść saneczki do komory elektroforetycznej

  2. Napełnić komorę buforem TAE 1x, w ilości która zapewni pokrycie żelu

  3. Nałożyć na żel: 3 µl markera wielkości (tzw. drabinki)

  4. Przygotować próby do nałożenia na żel: 10 µl DNA + 3 µl obciążnika, wymieszać przez przepipetowanie na wewnętrznej stronie parafilmu i nałożyć na żel

  5. Elektroforezę prowadzić przez 30-40 min / 100 V

  6. Po zakończonej elektroforezie przeanalizować wynik w świetle UV







©absta.pl 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna