Zbm 4 Charakterystyka spektralna barwników fotosyntetycznych Krzysztof Gibasiewicz Czas trwania ćwiczenia

Krzysztof Gibasiewicz

15 godzin lekcyjnych podzielonych na dwa (preferowany wariant) lub trzy spotkania w salach II PF).

Pisemna wejściówka na początku zajęć. Protokół pisemny na zakończenie (ewentualna obrona protokołu).

Na pierwsze zajęcia studenci przynoszą kilka gramów liści dwóch różnych roślin.

Na drugie zajęcia studenci pryznoszą 20-30 g świeżych liści szpinaku, pietruszki, rzodkiewki lub ewentualnie innych roślin.

Zasadniczym celem ćwiczenia jest zapoznanie się z właściwościami spektralnymi barwników fotsyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu). W tym celu zostaną przeprowadzone pomiary widm absorpcji i fluorescencji:

A) mieszaniny barwników fotosyntetycznych wyekstrahowanych z liści szpinaku (i ewentualnie innych roślin) za pomocą:

- acetonu,

- alkoholu metylowego;

B) izolowanych barwników fotsyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu);

C) chloroplastów szpinaku (i ewentualnie innych roślin).
Cele szczegółowe doświadczeń obejmują:

1) Określenie procentowej zawartości chlorofilu a i b w liściach różnych roślin.

2) Zbadanie wpływu różnych rozpuszczalników organicznych na właściwości spektralne barwników fotosyntetycznych (aceton, alkohol metylowy).

3) Porównanie widm emisji mieszaniny barwników fotosyntetycznych przy selektywnym wzbudzeniu chlorofilu a i chlorofilu b.

4) Porównanie widm absorpcji i emisji chlorofilu a i chlorofilu b.

5) Porównanie widma absorpcji z widmem wzbudzenia dla chlorofilu a oraz dla chlorofilu b.

6) Porównanie widma absorpcji z widmem emisji dla chlorofilu a oraz dla chlorofilu b – pomiar przesunięcia Stokesa.

7) Zbadanie wpływu otoczenia białkowego na widmo absorpcji i emisji barwników fotosyntetycznych.

8) Obserwacja przenoszenia energii wzbudzenia elektronowego w komplekasach białkowo-barwnikowych chloroplastów.
Opis doświadczeń:

Ad. A. Badanie mieszaniny wyekstrahowanych barwników fotosyntetycznych

Pierwsza część doświadczeń polega na wyekstrahowaniu mieszaniny barwników fotosyntetycznych z liści szpinaku (i ewentualnie innych roślin przyniesionych przez studentów – pietruszka, rzodkiewka, igły sosny, ...) i pomiarach widm absorpcji, emisji i wzbudzenia tej mieszaniny.

ABSORPCJA - RÓŻNE PRÓBKI

1) Odważyć ok. 2 g liści szpinaku i dwóch innych roślin.

2) Każdą z próbek starannie (przez kilka minut) homogenizować w ok. 15 ml (schłodzonego do 0°C) acetonu poprzez ucieranie w moździerzu (gumowe rękawiczki!).

3) Otrzymane zawiesiny przesączyć przez kilka warstw gazy (lub bibułę) do

kolb lub zlewek (30-100 ml) owiniętych folią aluminiową (gumowe rękawiczki!).

4) Zmierzyć objętość otrzymanego ekstraktu i wprowadzić do niego wodę destylowaną w o objętości cztery razy mniejszej niż objętość ekstraktu (w celu otrzymania 80 % wodnego roztworu acetonu).

5) Celem pozbycia się dużych cząsteczek odwirować próbki (10 minut, 10 000 rpm), a uzyskany supernatant ewentualnie dodatkowo przefiltrować (gumowe rękawiczki!) pod nadzorem osoby prowadzącej.

6) Zmierzyć widmo absorpcji ekstraktu w zakresie 380 -750 nm. Próbka referencyjna - 80% wodny roztwór acetonu. Rozcieńczyć (używając 80% wodny roztwór acetonu) roztwory próbek tak, aby uzyskać absorbancję równą około jeden w maksimum pasma Qy (przy ok. 660 nm). Powtórzyć pomiary widm. Zapisać je.

7) Odczytać absorbancję przy długości fali: 645, 652 i 663 nm.

8) Zawartość chlorofilu a (c_a), chlorofilu b (c_b) oraz oraz całkowitą zawartość chlorofilu (wyrażoną w mg/l) należy wyliczyć z następujących wzorów:

c_a = 12,7 A₆₆₃ – 2,7 A₆₄₅ (1)

c_b = 22,9 A₆₄₅ – 4,7 A₆₆₃ (2)

c_a + c_b = 20,2 A₆₄₅ + 8,0 A₆₆₃ (3)

c_a + c_b = 27,8 A₆₅₂ (4)

Sprawdzić i przedyskutować zgodność wyników otrzymanych ze wzoru (3) (otrzymanego ze wzorów (1) i (2)) i wzoru (4).

9) Obliczyć i porównać stosunek stężeń chlorofilu a do chlorofilu b dla badanych próbek.

10) Porównać na jednym wykresie widma absorpcji trzech próbek znormalizowanych w maksimum pasma Qy.

11) Dla jednej z próbek powtórzyć punkty 1-5 zastępując aceton alkoholem metylowym.

12) Porównać widma absorpcji próbki w dwóch różnych rozpuszczalnikach (znormalizowane jak w p. 9); określić położenia maksimów.
FLUORESCENCJA – WIDMA EMISJI

13) Zmierzyć i porównać widma emisji w zakresie do 750 nm trzech przygotowanych wcześniej próbek w acetonie oraz próbki w alkoholu metylowym. Określić długości fali maksimów fluorescencji. Użyć przynajmniej dwóch różnych długości fali światła wzbudzającego celem selektywnego wzbudzenia chlorofilu a (np. 400 lub 420 nm) i chlorofilu b (470 lub 480 nm). Stężenie badanych próbek powinno być tak dobrane, aby absorbancja w maksimum pasma Qy wynosił ok. 1.

14) Na podstawie uzyskanych widm wyciągnąć wnioski co do skuteczności selektywnego wzbudzania chlorofilu a i chlorofilu b.
FLUORESCENCJA – WIDMA WZBUDZENIA

15) Zmierzyć widma wzbudzenia przynajmniej dla jednej z próbek w zakresie 350 nm – 750 nm dla λ_em = 650, 660, 680, 690 i 700 nm.

16) Przedyskutować kształt uzyskanych widm, porównując je z widmami absorpcji chlorofilu a i b (patrz niżej) oraz ekstraktu barwników fotosyntetycznych (patrz wyżej).
PRZESUNIĘCIE STOKESA

17) Porównać na jednym wykresie znormalizowane widma absorpcji i emisji jednej z próbek i wyznaczyć przesunięcie Sokesa.

a) w 2 ml 80% wodnego roztworu acetonu,

b) w 2 ml metanolu.

2) Przygotować roztwory chlorofilu b i beta-karotenu podobnie jak w p. 1.

3) Zmierzyć widma absorpcji (380-750 nm) i rozcieńczyć odpowiednie próbki tymi samymi rozpuszczalnikami tak aby absorbancja pasma Qy chlorofili oraz absorbancja beta-karotenu w maksimum wynosiła ok. 1. Powtórzyć pomiary widm absorpcji. Zapisać je.

4) Zmierzyć

a) widma emisji emisji chlorofili

- w zakresie 420-750 nm przy wzbudzeniu ok. 400 nm – chlorofil a,

- w zakresie 500-750 nm przy wzbudzeniu ok. 480 nm – chlorofil b;

b) widmo emisji beta-karotenu po wzbudzeniu w maksimum absorpcji w zakresie od ~ 500 do 750 nm;

c) widma wzbudzenia chlorofilu a i b w zakresie od 380 nm do długości fali odpowiadającej wyraźnemu narastaniu pasma emisji.

5) Porównać i przedyskutować widma absorpcji, emisji i wzbudzenia

- dla różnych próbek,

- dla różnych rozpuszczalników,

oraz określić przesunięcia Stokesa.

6) Porównać i przedyskutować otrzymane wyniki z wynikami dla ekstraktów z liści.

7) Po skończonych zajęciach zlać wszystkie próbki do odpowiedniego kontenera lub umieścić w lodówce zależnie od wskazań osoby prowadzącej.
Ad. C. Badanie chloroplastów szpinaku (ewentualnie innych roślin)
IZOLACJA CHLOROPLASTÓW

1) Sprawdzić czy są przygotowane roztwory A i B (opisane w p. 2 i 3). Jeśli tak, przejść do punktu 4.

2) Sporządzić 500 ml roztworu A (0,4M sorbitolu z 0,01M NaCl).

3) Rozlać roztwór do dwóch zlewek po 250 ml. Do jednej ze zlewek dosypać 0,02M tris, celem przygotowania roztworu B (buforu homogenizującego).

4) Odważyć 15-20 g pietruszki lub liści rzodkiewki

5) Wrzucić liście do miksera jednocześnie dodając 50 ml roztworu B. Miksować kilkakrotnie przez 5 s. Unikać podgrzania liści.

6) Przesączyć zawiesinę przez warstwę gazy, następnie rozlać do probówek i wirować z prędkością 1400 lub 2000 rpm przez ok. 1 min.

7) Zlać supernatant do świeżej probówki. Zwirować ponownie z prędkością 10 000 rpm przez 5 minut.

8) Supernatant wylać, a pelet rozpuścić w 3 ml roztworu A.
POMIARY SPEKTROSKOPOWE I ICH ANALIZA

9) Rozcieńczyć małą ilość próbki roztworem A tak, aby otrzymać 2 ml roztworu o absorbancji ok. 1-1.5 Wykonać pomiary widma absorpcji.

10) Wykonać pomiary widm emisji i wzbudzenia analogiczne do tych przeprowadzonych na izolowanych barwnikach i wyekstrahowanej mieszaninie.

11) Porównać i przedyskutować uzyskane widma z tymi otrzymanymi dla izolowanych barwników i wyekstrahowanej mieszaniny.

12) Wyciągnąć wnioski co do transferu energii wzbudzenia elektronowego pomiędzy barwnikami w białkach fotosyntetycznych chloroplastów.

Materiały i sprzęt:

A. Liście szpinaku (może być mrożony) i dwóch innych roślin

Alkohol metylowy, aceton, woda destylowana

Gaza, bibuła, folia aluminiowa, rękawiczki gumowe

Moździeż, lejek, cylinder miarowy 25 lub 50 ml, 10 zlewek 30-100 ml, pipeta automatyczna 1-ml, strzykawka (preferowana szklana, do acetonu), filtry Millipore ~<1 μm (odporne na aceton, akohol metylowy)

Szklana kuwetka do pomiarów spektrofotometrycznych, 1 cm x 1 cm

Spektrofotometr UV-VIS, spektrofluorymetr, wirówka, waga

Kontener na roztwory organiczne

B. - dodatkowo:

Chlorofil a, chlorofil b, beta-karoten

Igły do strzykawki,

C. - dodatkowo:

20-30 g świeżych liści szpinaku, pietruszki, rzodkiewki lub ewentualnie innych roślin

Blender lub mikser

1) Zjawiska absorpcji i fluorescencji. Prawo Lamberta-Beera. Widma absorpcji, emisji i wzbudzenia. Przesunięcie Stokesa.

2) Barwniki fotosyntetyczne (chlorofil a, chlorofil b oraz beta-karoten) – struktura, widma absorpcji i emisji, schematy poziomów energetycznych.

3) Proces fotosyntezy

- ogólne równanie fotosyntezy,

- budowa i funkcjonownie molekularnego aparatu fotosyntetycznego (chloroplasty, tylakoidy, błony fotosyntetyczne, fotosystem I, fotosystem II, cytochrom bc1, ATP-aza, przenoszenie energii i elektronów).

4) Zasada działania i schemat budowy spektrometru fluorescencyjnego i absorpcyjnego.
Literatura (dostępna w większości w bibliotece Wydz. Fizyki UAM):

1) R.E. Blankenship, Molecular mechanisms of photosynthesis, Blackwell Sciences, 2002.

2) J.M. Berg, L. Stryer, J.L. Tymoczko, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007.

(wersja internetowa, po angielsku, na: stronie: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/)

3) L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999. Str. 571-573.

4) W.W. Parson, Modern Optical Spectroscopy, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2007.

5) C.A. Villee, E.P. Solomon, L.R. Berg, Biologia, Multico, 2006.

Niezbędne zakupy (100 zł):

- moździerz – 100zł?

Wskazane zakupy wg ważności (~2100 zł brutto):

1) chlorofil a, 1 mg – 480 zł netto,

2) chlorofil b, 1 mg - 480 zł netto,

3) beta-karoten, 5 g – 290 zł netto,

4) blender ~50 zł,

5) sączki bibułowe ~50 zł.

6) fltry Millipore ~<1 mikrometr, odporne na aceton i metanol – 400 zł?

: ~pf2 -> images -> Met-opisy
Met-opisy -> Spektroskopia laserowa: zek badanie widm absorpcji I fluorescencji związków organicznych z wykorzystaniem miniaturowego spektrometru ze wzbudzeniem laserowym. Cel ćwiczenia

Pobieranie 27.6 Kb.