ZBM_4 Charakterystyka spektralna barwników fotosyntetycznych
Krzysztof Gibasiewicz
Czas trwania ćwiczenia:
15 godzin lekcyjnych podzielonych na dwa (preferowany wariant) lub trzy spotkania w salach II PF).
Wymagania wobec studentów:
Pisemna wejściówka na początku zajęć. Protokół pisemny na zakończenie (ewentualna obrona protokołu).
Na pierwsze zajęcia studenci przynoszą kilka gramów liści dwóch różnych roślin.
Na drugie zajęcia studenci pryznoszą 20-30 g świeżych liści szpinaku, pietruszki, rzodkiewki lub ewentualnie innych roślin.
Cel ćwiczenia:
Zasadniczym celem ćwiczenia jest zapoznanie się z właściwościami spektralnymi barwników fotsyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu). W tym celu zostaną przeprowadzone pomiary widm absorpcji i fluorescencji:
A) mieszaniny barwników fotosyntetycznych wyekstrahowanych z liści szpinaku (i ewentualnie innych roślin) za pomocą:
- acetonu,
- alkoholu metylowego;
B) izolowanych barwników fotsyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu);
C) chloroplastów szpinaku (i ewentualnie innych roślin).
Cele szczegółowe doświadczeń obejmują:
1) Określenie procentowej zawartości chlorofilu a i b w liściach różnych roślin.
2) Zbadanie wpływu różnych rozpuszczalników organicznych na właściwości spektralne barwników fotosyntetycznych (aceton, alkohol metylowy).
3) Porównanie widm emisji mieszaniny barwników fotosyntetycznych przy selektywnym wzbudzeniu chlorofilu a i chlorofilu b.
4) Porównanie widm absorpcji i emisji chlorofilu a i chlorofilu b.
5) Porównanie widma absorpcji z widmem wzbudzenia dla chlorofilu a oraz dla chlorofilu b.
6) Porównanie widma absorpcji z widmem emisji dla chlorofilu a oraz dla chlorofilu b – pomiar przesunięcia Stokesa.
7) Zbadanie wpływu otoczenia białkowego na widmo absorpcji i emisji barwników fotosyntetycznych.
8) Obserwacja przenoszenia energii wzbudzenia elektronowego w komplekasach białkowo-barwnikowych chloroplastów.
Opis doświadczeń:
Ad. A. Badanie mieszaniny wyekstrahowanych barwników fotosyntetycznych
Pierwsza część doświadczeń polega na wyekstrahowaniu mieszaniny barwników fotosyntetycznych z liści szpinaku (i ewentualnie innych roślin przyniesionych przez studentów – pietruszka, rzodkiewka, igły sosny, ...) i pomiarach widm absorpcji, emisji i wzbudzenia tej mieszaniny.
Kolejność czynności:
ABSORPCJA - RÓŻNE PRÓBKI
1) Odważyć ok. 2 g liści szpinaku i dwóch innych roślin.
2) Każdą z próbek starannie (przez kilka minut) homogenizować w ok. 15 ml (schłodzonego do 0°C) acetonu poprzez ucieranie w moździerzu (gumowe rękawiczki!).
3) Otrzymane zawiesiny przesączyć przez kilka warstw gazy (lub bibułę) do
kolb lub zlewek (30-100 ml) owiniętych folią aluminiową (gumowe rękawiczki!).
4) Zmierzyć objętość otrzymanego ekstraktu i wprowadzić do niego wodę destylowaną w o objętości cztery razy mniejszej niż objętość ekstraktu (w celu otrzymania 80 % wodnego roztworu acetonu).
5) Celem pozbycia się dużych cząsteczek odwirować próbki (10 minut, 10 000 rpm), a uzyskany supernatant ewentualnie dodatkowo przefiltrować (gumowe rękawiczki!) pod nadzorem osoby prowadzącej.
6) Zmierzyć widmo absorpcji ekstraktu w zakresie 380 -750 nm. Próbka referencyjna - 80% wodny roztwór acetonu. Rozcieńczyć (używając 80% wodny roztwór acetonu) roztwory próbek tak, aby uzyskać absorbancję równą około jeden w maksimum pasma Qy (przy ok. 660 nm). Powtórzyć pomiary widm. Zapisać je.
7) Odczytać absorbancję przy długości fali: 645, 652 i 663 nm.
8) Zawartość chlorofilu a (ca), chlorofilu b (cb) oraz oraz całkowitą zawartość chlorofilu (wyrażoną w mg/l) należy wyliczyć z następujących wzorów:
ca = 12,7 A663 – 2,7 A645 (1)
cb = 22,9 A645 – 4,7 A663 (2)
ca + cb = 20,2 A645 + 8,0 A663 (3)
ca + cb = 27,8 A652 (4)
Sprawdzić i przedyskutować zgodność wyników otrzymanych ze wzoru (3) (otrzymanego ze wzorów (1) i (2)) i wzoru (4).
9) Obliczyć i porównać stosunek stężeń chlorofilu a do chlorofilu b dla badanych próbek.
10) Porównać na jednym wykresie widma absorpcji trzech próbek znormalizowanych w maksimum pasma Qy.
ABSORPCJA - RóżNE ROZPUSZCZALNIKI
11) Dla jednej z próbek powtórzyć punkty 1-5 zastępując aceton alkoholem metylowym.
12) Porównać widma absorpcji próbki w dwóch różnych rozpuszczalnikach (znormalizowane jak w p. 9); określić położenia maksimów.
FLUORESCENCJA – WIDMA EMISJI
13) Zmierzyć i porównać widma emisji w zakresie do 750 nm trzech przygotowanych wcześniej próbek w acetonie oraz próbki w alkoholu metylowym. Określić długości fali maksimów fluorescencji. Użyć przynajmniej dwóch różnych długości fali światła wzbudzającego celem selektywnego wzbudzenia chlorofilu a (np. 400 lub 420 nm) i chlorofilu b (470 lub 480 nm). Stężenie badanych próbek powinno być tak dobrane, aby absorbancja w maksimum pasma Qy wynosił ok. 1.
14) Na podstawie uzyskanych widm wyciągnąć wnioski co do skuteczności selektywnego wzbudzania chlorofilu a i chlorofilu b.
FLUORESCENCJA – WIDMA WZBUDZENIA
15) Zmierzyć widma wzbudzenia przynajmniej dla jednej z próbek w zakresie 350 nm – 750 nm dla λem = 650, 660, 680, 690 i 700 nm.
16) Przedyskutować kształt uzyskanych widm, porównując je z widmami absorpcji chlorofilu a i b (patrz niżej) oraz ekstraktu barwników fotosyntetycznych (patrz wyżej).
PRZESUNIĘCIE STOKESA
17) Porównać na jednym wykresie znormalizowane widma absorpcji i emisji jednej z próbek i wyznaczyć przesunięcie Sokesa.
18) Po skończonych zajęciach zlać wszystkie próbki do odpowiedniego kontenera lub umieścić w lodówce zależnie od wskazań osoby prowadzącej.
Ad. B. Badanie izolowanych barwników fotsyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu).
1) Rozpuścić minimalną ilość chlorofilu a (nabranego za pomocą igły)
a) w 2 ml 80% wodnego roztworu acetonu,
b) w 2 ml metanolu.
2) Przygotować roztwory chlorofilu b i beta-karotenu podobnie jak w p. 1.
3) Zmierzyć widma absorpcji (380-750 nm) i rozcieńczyć odpowiednie próbki tymi samymi rozpuszczalnikami tak aby absorbancja pasma Qy chlorofili oraz absorbancja beta-karotenu w maksimum wynosiła ok. 1. Powtórzyć pomiary widm absorpcji. Zapisać je.
4) Zmierzyć
a) widma emisji emisji chlorofili
- w zakresie 420-750 nm przy wzbudzeniu ok. 400 nm – chlorofil a,
- w zakresie 500-750 nm przy wzbudzeniu ok. 480 nm – chlorofil b;
b) widmo emisji beta-karotenu po wzbudzeniu w maksimum absorpcji w zakresie od ~ 500 do 750 nm;
c) widma wzbudzenia chlorofilu a i b w zakresie od 380 nm do długości fali odpowiadającej wyraźnemu narastaniu pasma emisji.
5) Porównać i przedyskutować widma absorpcji, emisji i wzbudzenia
- dla różnych próbek,
- dla różnych rozpuszczalników,
oraz określić przesunięcia Stokesa.
6) Porównać i przedyskutować otrzymane wyniki z wynikami dla ekstraktów z liści.
7) Po skończonych zajęciach zlać wszystkie próbki do odpowiedniego kontenera lub umieścić w lodówce zależnie od wskazań osoby prowadzącej.
Ad. C. Badanie chloroplastów szpinaku (ewentualnie innych roślin)
IZOLACJA CHLOROPLASTÓW
1) Sprawdzić czy są przygotowane roztwory A i B (opisane w p. 2 i 3). Jeśli tak, przejść do punktu 4.
2) Sporządzić 500 ml roztworu A (0,4M sorbitolu z 0,01M NaCl).
3) Rozlać roztwór do dwóch zlewek po 250 ml. Do jednej ze zlewek dosypać 0,02M tris, celem przygotowania roztworu B (buforu homogenizującego).
4) Odważyć 15-20 g pietruszki lub liści rzodkiewki
5) Wrzucić liście do miksera jednocześnie dodając 50 ml roztworu B. Miksować kilkakrotnie przez 5 s. Unikać podgrzania liści.
6) Przesączyć zawiesinę przez warstwę gazy, następnie rozlać do probówek i wirować z prędkością 1400 lub 2000 rpm przez ok. 1 min.
7) Zlać supernatant do świeżej probówki. Zwirować ponownie z prędkością 10 000 rpm przez 5 minut.
8) Supernatant wylać, a pelet rozpuścić w 3 ml roztworu A.
POMIARY SPEKTROSKOPOWE I ICH ANALIZA
9) Rozcieńczyć małą ilość próbki roztworem A tak, aby otrzymać 2 ml roztworu o absorbancji ok. 1-1.5 Wykonać pomiary widma absorpcji.
10) Wykonać pomiary widm emisji i wzbudzenia analogiczne do tych przeprowadzonych na izolowanych barwnikach i wyekstrahowanej mieszaninie.
11) Porównać i przedyskutować uzyskane widma z tymi otrzymanymi dla izolowanych barwników i wyekstrahowanej mieszaniny.
12) Wyciągnąć wnioski co do transferu energii wzbudzenia elektronowego pomiędzy barwnikami w białkach fotosyntetycznych chloroplastów.
Materiały i sprzęt:
A. Liście szpinaku (może być mrożony) i dwóch innych roślin
Alkohol metylowy, aceton, woda destylowana
Gaza, bibuła, folia aluminiowa, rękawiczki gumowe
Moździeż, lejek, cylinder miarowy 25 lub 50 ml, 10 zlewek 30-100 ml, pipeta automatyczna 1-ml, strzykawka (preferowana szklana, do acetonu), filtry Millipore ~<1 μm (odporne na aceton, akohol metylowy)
Szklana kuwetka do pomiarów spektrofotometrycznych, 1 cm x 1 cm
Spektrofotometr UV-VIS, spektrofluorymetr, wirówka, waga
Kontener na roztwory organiczne
B. - dodatkowo:
Chlorofil a, chlorofil b, beta-karoten
Igły do strzykawki,
C. - dodatkowo:
20-30 g świeżych liści szpinaku, pietruszki, rzodkiewki lub ewentualnie innych roślin
Blender lub mikser
Zagadnienia do przygotowania:
1) Zjawiska absorpcji i fluorescencji. Prawo Lamberta-Beera. Widma absorpcji, emisji i wzbudzenia. Przesunięcie Stokesa.
2) Barwniki fotosyntetyczne (chlorofil a, chlorofil b oraz beta-karoten) – struktura, widma absorpcji i emisji, schematy poziomów energetycznych.
3) Proces fotosyntezy
- ogólne równanie fotosyntezy,
- budowa i funkcjonownie molekularnego aparatu fotosyntetycznego (chloroplasty, tylakoidy, błony fotosyntetyczne, fotosystem I, fotosystem II, cytochrom bc1, ATP-aza, przenoszenie energii i elektronów).
4) Zasada działania i schemat budowy spektrometru fluorescencyjnego i absorpcyjnego.
Literatura (dostępna w większości w bibliotece Wydz. Fizyki UAM):
1) R.E. Blankenship, Molecular mechanisms of photosynthesis, Blackwell Sciences, 2002.
2) J.M. Berg, L. Stryer, J.L. Tymoczko, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007. (wersja internetowa, po angielsku, na: stronie: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/)
3) L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999. Str. 571-573.
4) W.W. Parson, Modern Optical Spectroscopy, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2007.
5) C.A. Villee, E.P. Solomon, L.R. Berg, Biologia, Multico, 2006.
Niezbędne zakupy (100 zł):
- moździerz – 100zł?
Wskazane zakupy wg ważności (~2100 zł brutto):
1) chlorofil a, 1 mg – 480 zł netto,
2) chlorofil b, 1 mg - 480 zł netto,
3) beta-karoten, 5 g – 290 zł netto,
4) blender ~50 zł,
5) sączki bibułowe ~50 zł.
6) fltry Millipore ~<1 mikrometr, odporne na aceton i metanol – 400 zł?
1>1>
|